蛋白實(shí)驗(yàn)雙向電泳技術(shù)是等電聚焦和十二烷基硫酸銨-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)的組合,即先進(jìn)行等電聚焦電泳(按照蛋白質(zhì)等電點(diǎn)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離),然后再進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳(按照蛋白質(zhì)相對(duì)分子量大小對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離),最后經(jīng)染色得到的電泳圖是個(gè)二維分布的蛋白質(zhì)圖。
等電位聚焦是一種根據(jù)分子攜帶的電荷不同來(lái)分離分子的技術(shù)。蛋白質(zhì)同時(shí)具有酸性基團(tuán)和堿性基團(tuán),在ph值低于等電點(diǎn)時(shí)會(huì)帶有正電荷,在電場(chǎng)中向陰極移動(dòng)。將蛋白質(zhì)置于有遞增ph梯度的凝膠中電泳,蛋白質(zhì)所帶電荷會(huì)一直減少,直到蛋白質(zhì)移動(dòng)到ph值與其等電點(diǎn)相同的區(qū)域。在此處,蛋白質(zhì)靜電荷為0,因此停止運(yùn)動(dòng),最終蛋白質(zhì)被“聚焦”在ph值和其等電點(diǎn)相同的窄帶中。
蛋白實(shí)驗(yàn)蛋白質(zhì)雙向電泳實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng):
1.TCA:TCA有毒性,有刺激性氣味,損害呼吸道、眼睛及皮膚,稱量時(shí)應(yīng)戴手套及口罩,避免沾到皮膚及吸入,若不慎接觸,應(yīng)立即用大量水沖洗后就醫(yī)。TCA易潮解,稱量時(shí)應(yīng)迅速。
2.PMSF:PMSF有毒,嚴(yán)重?fù)p害呼吸道粘膜、眼睛及皮膚,稱量時(shí)應(yīng)戴手套及口罩,避免沾到皮膚及吸入,若不慎接觸,應(yīng)立即用大量水沖洗后就醫(yī)。PMSF溶于異丙醇后置于-20℃長(zhǎng)期保存,保存中易析出結(jié)晶,用前取出待結(jié)晶溶化后再使用
3.甲醛:有刺激性氣味,易揮發(fā),其蒸汽強(qiáng)烈刺激粘膜、眼睛,具有致癌性。使用時(shí)應(yīng)戴手套及口罩,在通風(fēng)櫥內(nèi)操作。
4.甲醇:有毒,能引起失明。DTT:很強(qiáng)的還原性,散發(fā)難聞的氣味??梢蛭?、咽下或皮膚吸收危害健康。當(dāng)使用固體或高濃度儲(chǔ)存液時(shí),戴手套和護(hù)目鏡,在通風(fēng)櫥中操作。beta-巰基乙醇:可致命,對(duì)呼吸道、皮膚和眼睛有傷害。丙酮:對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)有麻醉作用,并對(duì)黏膜有刺激作用。