一、細(xì)胞轉(zhuǎn)染
細(xì)胞轉(zhuǎn)染是指將外源分子如DNA,RNA等導(dǎo)入真核細(xì)胞的技術(shù)。常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)可分為瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染兩大類。本實(shí)驗(yàn)室主要是質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、miRcroRNA轉(zhuǎn)染、慢病毒轉(zhuǎn)染、藥物轉(zhuǎn)染、多肽轉(zhuǎn)染等。
二、miRcroRNA轉(zhuǎn)染
(一)實(shí)驗(yàn)材料及試劑
六孔板、CO2培養(yǎng)箱、EP管、酒精燈等;無血清培養(yǎng)基、MEM-α或DMEM、RNA、lipofectamine 2000、MSC細(xì)胞等。
(二)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
1當(dāng)六孔板中MSC細(xì)胞密度達(dá)90%時,準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染,將無血清培養(yǎng)基、MEM-α或DMEM取出復(fù)溫并注意平衡好;
2取出細(xì)胞,將培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基,放回孵箱培養(yǎng);
3取滅菌的EP管,按要求混好RNA(約100pmol/孔),每管250ul DMEM,混勻;
4另取EP管,加入lipofectamine 2000(5 ul/孔)和MEM-α或DMEM(250ul/孔),輕輕混勻后室溫靜置5min;
5將上述兩個EP管混勻;
6室溫靜置20min,將lipofectamine 2000-質(zhì)?;旌弦旱蔚搅装逯校?00ul/孔;
7將細(xì)胞放回孵箱培養(yǎng),4h后換回含血清的*培養(yǎng)基。
(三)注意事項(xiàng)
1轉(zhuǎn)染的時候培養(yǎng)基中不能添加抗生素??股?,比如青霉素和鏈霉素,一般對于真核細(xì)胞無毒,但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細(xì)胞的通透性,使抗生素可以進(jìn)入細(xì)胞。這降低了細(xì)胞的活性,導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低。所以,在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中不能使用抗生素。
2如果在無血清條件下轉(zhuǎn)染,使用含血清的正常生長培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞鋪板。在加入復(fù)合物前移去生長培養(yǎng)基,替換為0.5mL無血清培養(yǎng)基。
3在37℃,5%的CO2中保溫24-48小時,無須去掉復(fù)合物或更換培養(yǎng)基或者在4-5小時后更換生長培養(yǎng)基也不會降低轉(zhuǎn)染活性。
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