1. C57小鼠,8-10周,通過頸椎脫位處死,浸入75%乙醇浸泡5分鐘,轉(zhuǎn)移到通風(fēng)柜中的解剖盤中。
2. 使用眼科剪和鑷子,使髖關(guān)節(jié)脫臼,保持股骨頭完整。
3. 用止血鉗去除每個股骨頭的軟骨帽,將組織放入含2%雙抗的PBS中。
4. 用冰冷的含2%雙抗的PBS清洗2-3遍,將關(guān)節(jié)軟骨小心移到2ml離心管中。
5. 用眼科剪刀將軟骨帽剪成約1mm3的碎片,加入3ml預(yù)熱的Collagenase D(1.5mg/ml)。
6. 放入37℃、80rpm的搖床中進行第一次消化,時間2h 。
7. 第一次消化結(jié)束后,加入含血清的培養(yǎng)基終止消化,40um的細(xì)胞篩過濾后,離心1500rpm,2min。
8. 沉淀用DMEM完丨全培養(yǎng)基重懸,計數(shù),種植在24孔板中。
9. 在未消化的組織中加入3ml預(yù)熱的Collagenase D,放入37℃、80rpm的搖床中進行第二次消化,時間2h,然后收集細(xì)胞。
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