激光共聚焦實(shí)驗(yàn)是一種高分辨率的光學(xué)顯微技術(shù),廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和材料科學(xué)等領(lǐng)域。其原理是利用激光束掃描樣本,并通過光學(xué)系統(tǒng)將樣本的熒光信號(hào)收集到探測(cè)器中。首先,一個(gè)激光束通過一個(gè)鏡面反射器被聚焦在樣品上的一個(gè)點(diǎn)上。激光束的波長(zhǎng)通常在可見光范圍內(nèi),例如綠光或紅光。聚焦點(diǎn)的大小取決于激光束的直徑和聚焦鏡頭的數(shù)值孔徑,較小的聚焦點(diǎn)意味著更高的分辨率。當(dāng)激光束聚焦在樣品上時(shí),該點(diǎn)處的熒光染料或標(biāo)記物會(huì)被激發(fā),并發(fā)射出熒光信號(hào)。由于激光束只聚焦在一個(gè)點(diǎn)上,只有該點(diǎn)處的熒光信號(hào)會(huì)被收集到探測(cè)器中。接下來,激光束通過一個(gè)掃描和反射系統(tǒng)來移動(dòng)到樣品的下一個(gè)位置,以便掃描整個(gè)樣品。這個(gè)系統(tǒng)通常由鏡子和透鏡組成,可以引導(dǎo)激光束按照預(yù)定的路徑掃描樣品。
1、樣品制備
細(xì)胞培養(yǎng)和處理:首先將培養(yǎng)好的細(xì)胞用PBS緩沖液洗滌兩次,去除培養(yǎng)基中的雜質(zhì)。加入適量的熒光染料進(jìn)行標(biāo)記,與細(xì)胞孵育一定時(shí)間,使染料能充分進(jìn)入細(xì)胞并標(biāo)記目標(biāo)分子。
固定和透膜處理:用4%多聚甲醛固定細(xì)胞,然后用0.1%Triton-X 100進(jìn)行透膜處理,以便于染料和抗體的滲透。
封閉和染色:使用5%PBS脫脂乳進(jìn)行封閉處理,隨后加入一抗和二抗,分別孵育1小時(shí),并進(jìn)行多次PBS清洗去除多余的染料和抗體。最后,用DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色。
2、顯微鏡設(shè)置
啟動(dòng)顯微鏡和激光器:打開激光共聚焦顯微鏡的電源,啟動(dòng)激光器和計(jì)算機(jī)。在操作軟件中選擇適當(dāng)?shù)臒晒鈽悠芳ぐl(fā)波長(zhǎng),并調(diào)整相應(yīng)的濾光片組塊。
焦距和掃描設(shè)置:在目視模式下調(diào)整物鏡放大倍數(shù),找到需要檢測(cè)的細(xì)胞。切換到掃描模式,調(diào)整雙孔針和激光強(qiáng)度參數(shù),以獲得清晰的共聚焦圖像。
3、數(shù)據(jù)采集
圖像獲?。哼x擇合適的圖像分辨率,將樣品完整掃描后保存圖像結(jié)果。如果需要三維圖像,則選用“Z-Stack”模式,確定光學(xué)切片的位置及層數(shù),獲得一系列光學(xué)切片圖像。
時(shí)間序列圖像:如果需要進(jìn)行時(shí)間序列成像,設(shè)定所需的時(shí)間間隔和所需圖像數(shù)量,開啟“Time-Series”功能鍵,自動(dòng)在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)按照設(shè)定的時(shí)間間隔獲取圖像。
4、數(shù)據(jù)分析
圖像處理:使用圖像處理軟件對(duì)采集到的圖像進(jìn)行處理和分析,如亮度、對(duì)比度調(diào)整,以及測(cè)量目標(biāo)分子的熒光強(qiáng)度等。
結(jié)果導(dǎo)出:將處理后的圖像和數(shù)據(jù)導(dǎo)出,用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)分析和報(bào)告撰寫。