欲色AV无码一区二区人妻,高H小月被几个老头调教,精品伦理一区二区三区,成人伊人青草久久综合网

咨詢熱線

18017847121

當前位置:首頁  >  技術文章  >  Nature重磅!CRISPR–Cas9 篩選揭示神經干細胞衰老調控因子

Nature重磅!CRISPR–Cas9 篩選揭示神經干細胞衰老調控因子

更新時間:2024-10-23      點擊次數:160

各位讀者好,今天解讀的文章是10月最新發(fā)表在《Nature》(Q1,IF69.5)上的,題為‘CRISPR–Cas9 screens reveal regulators of ageing in neural stem cells’,中文譯名:CRISPR–Cas9 篩選揭示神經干細胞衰老調控因子。?


我們知道神經干細胞(NSCs)是大腦中的一類重要細胞,它們在成年期負責新神經元的生成和腦損傷后的組織修復。然而,隨著年齡的增長,NSCs的功能會逐漸下降,導致新神經元產生減少和損傷后再生能力下降。


盡管過去已有研究通過遺傳干預改善了老年大腦的功能,但對老年NSCs的系統(tǒng)性功能測試尚未進行。因此,本篇文章旨在通過開發(fā)體外和體內高通量CRISPR–Cas9篩選平臺,系統(tǒng)地鑒定能夠促進老年小鼠NSCs激活的基因敲除,這些研究不僅為理解老年NSCs的功能衰退提供了新的分子機制,也為開發(fā)抗衰老干預措施提供了潛在的靶點和新措施



實驗方法與目的


研究人員首先在體外建立了基于CRISPR–Cas9的基因敲除篩選平臺,通過在年輕和老年小鼠的NSCs原代培養(yǎng)中進行全基因組篩選,鑒定出能夠特異性恢復老年NSCs激活的基因敲除。接著,研究人員在體內建立CRISPR–Cas9篩選平臺,通過在老年小鼠大腦中進行基因敲除,鑒定出能夠促進NSCs激活和新神經元產生的基因。


體外篩選平臺的建立


1. sgRNA的設計:研究人員首先根據目標基因序列設計特定的單鏈引導RNA(sgRNA)。

2. 構建編輯載體:將設計好的sgRNA序列克隆到表達Cas9蛋白的質粒或病毒載體中。

3. 細胞轉染:將構建好的CRISPR–Cas9載體導入目標細胞,如神經干細胞。

4. 篩選和驗證:通過抗生素篩選、PCR和測序等分子生物學方法,篩選獲得基因編輯效果的細胞,并驗證基因敲除效果。

5.功能分析:研究敲除基因后細胞的表型變化和功能影響,如細胞增殖、分化、遷移等。


體內篩選平臺的建立


1.立體定位腦內注射:研究人員通過立體定位手術將攜帶sgRNA的慢病毒直接注入老年Cas9小鼠的側腦室,靠近神經干細胞的微環(huán)境(SVZ)。

2.基因敲除效果的驗證:幾周后,收集小鼠的嗅球(OB),通過基因組測序分析sgRNA的富集情況,以評估基因敲除的效果。

3.免疫熒光成像:對注射后的腦組織進行免疫熒光染色,以驗證基因敲除對神經干細胞激活和神經發(fā)生的影響。

4. 基因敲除效率的評估:通過流式細胞術(FACS)和Western Blot等技術,評估基因敲除的效率和特異性。


這些平臺的建立為研究人員提供了強大的工具,以系統(tǒng)地研究老年神經干細胞的衰老機制,并為開發(fā)抗衰老干預措施提供了新的策略。通過這些技術,研究人員能夠精確地敲除特定的基因,并評估這些基因敲除對細胞功能的影響,從而揭示調控神經干細胞衰老的關鍵分子途徑。


結果分析


體外篩選平臺的建立與基因靶點鑒定


研究人員通過體外篩選平臺,對年輕和老年NSCs進行了全基因組CRISPR–Cas9篩選。通過高通量篩選,研究者發(fā)現了300多個基因靶點,這些靶點敲除能夠特異性地恢復老年NSCs的激活(圖1a-c)。這些基因靶點主要涉及纖毛組織和葡萄糖攝取過程,提示這些生物學過程可能在NSCs的衰老中發(fā)揮重要作用。


圖片


體內篩選平臺的建立與基因敲除的鑒定


為了驗證體外篩選結果的體內效應,研究者還建立了一個體內CRISPR–Cas9篩選平臺。通過在老年小鼠大腦中進行基因敲除,研究者鑒定出24個基因靶點,這些靶點能夠促進NSCs的激活和新神經元的產生(圖2a-d)。這些結果表明,通過CRISPR–Cas9技術在體內進行基因敲除是一種有效的策略,可以用于研究老年NSCs的功能衰退。


圖片


Slc2a4基因敲除對老年NSCs功能的影響


在所有鑒定出的基因敲除的靶點中,Slc2a4基因(編碼GLUT4葡萄糖轉運蛋白)的敲除是提高老年NSCs功能的zui有效干預措施之一(圖3a-d)。研究者發(fā)現,隨著年齡的增長,NSCs中的葡萄糖攝取增加,而短暫的葡萄糖饑餓可以恢復老年NSCs的激活能力。因此,葡萄糖攝取的增加,可能會加速隨年齡增長而導致的NSCs激活能力的下降。


圖片


老年NSCs的高葡萄糖攝取及其對NSC激活的影響


研究者進一步分析了老年NSCs的葡萄糖攝取特性。通過體外實驗,研究者發(fā)現老年qNSCs和aNSCs的葡萄糖攝取是年輕對照組的兩倍(圖4a-f),說明通過遺傳或通過葡萄糖限制來逆轉這種增加,可以促進老年NSCs的激活。這些結果表明,老年qNSCs處于高葡萄糖攝取狀態(tài),這可能是由于隨著年齡的增長GLUT4表達的增加。然而,這種狀態(tài)可以通過遺傳或葡萄糖限制干預來逆轉,以促進老年qNSCs的激活。


圖片



文章結果


本研究中,我們利用CRISPR-Cas9篩選平臺成功鑒定了300多個能夠促進老年神經干細胞(NSCs)激活的基因靶點,其中Slc2a4基因的敲除是提高老年NSCs功能的zui有效干預措施之一。此外,研究還發(fā)現老年NSCs表現出高葡萄糖攝取,這一特性可以通過遺傳或葡萄糖限制干預來逆轉,進而促進老年NSCs的激活。這些發(fā)現為老年NSCs的功能衰退的研究提供了新的見解,并為開發(fā)抗衰老干預藥物提供了潛在靶點。




未來研究方向




本文通過CRISPR-Cas9篩選平臺揭示了老年神經干細胞(NSCs)中葡萄糖代謝的變化,特別是GLUT4(Slc2a4)在老年NSCs中的作用。結合這一發(fā)現及近年來國家自然科學基金熱點相關領域,未來可以繼續(xù)探索GLUT4相關的信號通路(如胰島素/IGF信號通路)在NSCs衰老中的作用,以及這些信號通路如何影響衰老相關的變化,或是開發(fā)新的基因編輯工具和技術,以更精確地研究和調控NSCs的代謝狀態(tài)和功能。

此外,還可以探索其他干細胞類型(如造血干細胞和肌肉干細胞)中是否也存在類似的代謝變化,并研究這些變化是否對細胞功能有類似的影響?;蚩赏ㄟ^探索GLUT4敲除或葡萄糖限制干預是否能夠在其他組織或器官中促進細胞的再生和修復,發(fā)現延緩衰老過程的機制。



上海達為科生物科技有限公司
  • 聯(lián)系人:張
  • 地址:上海市長江南路180號長江軟件園B區(qū)B637室
  • 郵箱:2844970554@qq.com
  • 傳真:
關注我們

歡迎您關注我們的微信公眾號了解更多信息

掃一掃
關注我們
版權所有©2024上海達為科生物科技有限公司All Rights Reserved    備案號:滬ICP備15041491號-2    sitemap.xml    總流量:115714
管理登陸    技術支持:化工儀器網    
湖州市| 江北区| 措勤县| 东城区| 西青区| 武城县| 伊吾县| 武义县| 桃江县| 富民县| 石柱| 乌海市| 靖安县| 仁化县| 通海县| 旬阳县| 酉阳| 且末县| 海原县| 武定县| 页游| 新疆| 罗田县| 临桂县| 凤阳县| 繁峙县| 墨江| 巴东县| 柘荣县| 奎屯市| 井冈山市| 武乡县| 紫阳县| 凤台县| 甘泉县| 苏尼特右旗| 阿克| 井冈山市| 石屏县| 阿拉尔市| 伊金霍洛旗|