各位讀者好,今天解讀的文章是10月最新發(fā)表在《Nature》(Q1,IF69.5)上的,題為‘CRISPR–Cas9 screens reveal regulators of ageing in neural stem cells’,中文譯名:CRISPR–Cas9 篩選揭示神經干細胞衰老調控因子。?
我們知道神經干細胞(NSCs)是大腦中的一類重要細胞,它們在成年期負責新神經元的生成和腦損傷后的組織修復。然而,隨著年齡的增長,NSCs的功能會逐漸下降,導致新神經元產生減少和損傷后再生能力下降。
盡管過去已有研究通過遺傳干預改善了老年大腦的功能,但對老年NSCs的系統(tǒng)性功能測試尚未進行。因此,本篇文章旨在通過開發(fā)體外和體內高通量CRISPR–Cas9篩選平臺,系統(tǒng)地鑒定能夠促進老年小鼠NSCs激活的基因敲除,這些研究不僅為理解老年NSCs的功能衰退提供了新的分子機制,也為開發(fā)抗衰老干預措施提供了潛在的靶點和新措施
研究人員首先在體外建立了基于CRISPR–Cas9的基因敲除篩選平臺,通過在年輕和老年小鼠的NSCs原代培養(yǎng)中進行全基因組篩選,鑒定出能夠特異性恢復老年NSCs激活的基因敲除。接著,研究人員在體內建立CRISPR–Cas9篩選平臺,通過在老年小鼠大腦中進行基因敲除,鑒定出能夠促進NSCs激活和新神經元產生的基因。
體外篩選平臺的建立
1. sgRNA的設計:研究人員首先根據目標基因序列設計特定的單鏈引導RNA(sgRNA)。
2. 構建編輯載體:將設計好的sgRNA序列克隆到表達Cas9蛋白的質粒或病毒載體中。
3. 細胞轉染:將構建好的CRISPR–Cas9載體導入目標細胞,如神經干細胞。
4. 篩選和驗證:通過抗生素篩選、PCR和測序等分子生物學方法,篩選獲得基因編輯效果的細胞,并驗證基因敲除效果。
5.功能分析:研究敲除基因后細胞的表型變化和功能影響,如細胞增殖、分化、遷移等。
體內篩選平臺的建立
1.立體定位腦內注射:研究人員通過立體定位手術將攜帶sgRNA的慢病毒直接注入老年Cas9小鼠的側腦室,靠近神經干細胞的微環(huán)境(SVZ)。
2.基因敲除效果的驗證:幾周后,收集小鼠的嗅球(OB),通過基因組測序分析sgRNA的富集情況,以評估基因敲除的效果。
3.免疫熒光成像:對注射后的腦組織進行免疫熒光染色,以驗證基因敲除對神經干細胞激活和神經發(fā)生的影響。
4. 基因敲除效率的評估:通過流式細胞術(FACS)和Western Blot等技術,評估基因敲除的效率和特異性。
這些平臺的建立為研究人員提供了強大的工具,以系統(tǒng)地研究老年神經干細胞的衰老機制,并為開發(fā)抗衰老干預措施提供了新的策略。通過這些技術,研究人員能夠精確地敲除特定的基因,并評估這些基因敲除對細胞功能的影響,從而揭示調控神經干細胞衰老的關鍵分子途徑。
體外篩選平臺的建立與基因靶點鑒定
研究人員通過體外篩選平臺,對年輕和老年NSCs進行了全基因組CRISPR–Cas9篩選。通過高通量篩選,研究者發(fā)現了300多個基因靶點,這些靶點敲除能夠特異性地恢復老年NSCs的激活(圖1a-c)。這些基因靶點主要涉及纖毛組織和葡萄糖攝取過程,提示這些生物學過程可能在NSCs的衰老中發(fā)揮重要作用。
體內篩選平臺的建立與基因敲除的鑒定
為了驗證體外篩選結果的體內效應,研究者還建立了一個體內CRISPR–Cas9篩選平臺。通過在老年小鼠大腦中進行基因敲除,研究者鑒定出24個基因靶點,這些靶點能夠促進NSCs的激活和新神經元的產生(圖2a-d)。這些結果表明,通過CRISPR–Cas9技術在體內進行基因敲除是一種有效的策略,可以用于研究老年NSCs的功能衰退。
Slc2a4基因敲除對老年NSCs功能的影響
在所有鑒定出的基因敲除的靶點中,Slc2a4基因(編碼GLUT4葡萄糖轉運蛋白)的敲除是提高老年NSCs功能的zui有效干預措施之一(圖3a-d)。研究者發(fā)現,隨著年齡的增長,NSCs中的葡萄糖攝取增加,而短暫的葡萄糖饑餓可以恢復老年NSCs的激活能力。因此,葡萄糖攝取的增加,可能會加速隨年齡增長而導致的NSCs激活能力的下降。
老年NSCs的高葡萄糖攝取及其對NSC激活的影響
研究者進一步分析了老年NSCs的葡萄糖攝取特性。通過體外實驗,研究者發(fā)現老年qNSCs和aNSCs的葡萄糖攝取是年輕對照組的兩倍(圖4a-f),說明通過遺傳或通過葡萄糖限制來逆轉這種增加,可以促進老年NSCs的激活。這些結果表明,老年qNSCs處于高葡萄糖攝取狀態(tài),這可能是由于隨著年齡的增長GLUT4表達的增加。然而,這種狀態(tài)可以通過遺傳或葡萄糖限制干預來逆轉,以促進老年qNSCs的激活。