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簡要描述:實時熒光定量PCR檢測 PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針,該探針為一寡核苷酸,兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時,報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收;剛開始時,探針結(jié)合在DNA任意一條單鏈上;PCR擴增時,Taq酶的5'端一3'端外切酶活性將探針酶切降解,使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離,從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號。
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聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)自誕生之日起就決定了它不僅是一種高敏感、高特異的檢測核酸分子的定性方法,而且也是一個能對核酸分子進(jìn)行定量的有力工具。1996年,美國Applied Biosystems公司推出了一種新定量試驗技術(shù)間實時熒光定量PCR它是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤;實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程,結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對產(chǎn)物進(jìn)行分析,計算待測樣品模板的初始濃度。
實時熒光定量PCR服務(wù)內(nèi)容:
PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針,該探針為一寡核苷酸,兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時,報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收;剛開始時,探針結(jié)合在DNA任意一條單鏈上;PCR擴增時,Taq酶的5'端一3'端外切酶活性將探針酶切降解,使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離,從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號,即每擴增一條DNA鏈,就有一個熒光分子形成,實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。
實時熒光定量PCR樣品準(zhǔn)備條件:
細(xì)胞樣品:收集細(xì)胞后放入液氮中速凍保存或速東24h后轉(zhuǎn)入-80°C冰箱保存;收集細(xì)胞后,視細(xì)胞量,直接加入1-1.5mL Trizol溶解裂解細(xì)胞,再轉(zhuǎn)入-80°C冰箱保存。
組織樣品:動物組織一般取材后立即放入液氮中速凍保存,液氮凍存24h后可轉(zhuǎn)入-80°C冰箱保存;組織樣品同樣可以采用Trizol溶解裂解后放入-80°C冰箱保存。特殊組織(植物等)建議采用新鮮組織即刻提取RNA,逆轉(zhuǎn)合成cDNA后-20°C保存?zhèn)溆谩K袠悠返奶幚砗捅4孢^程中,切總反復(fù)凍融。
樣品運輸條件:樣品運輸條件根據(jù)實驗樣品的處理條件,可以選擇液氮或者干冰運輸。
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