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簡要描述:細(xì)胞Transwell檢測技術(shù)服務(wù)是達(dá)為科生物的基礎(chǔ)服務(wù)項目之一,由細(xì)胞平臺經(jīng)驗豐富的實驗人員操作完成。
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細(xì)胞遷移運動普遍存在于組織發(fā)育、傷口愈合、血管發(fā)生等許多正常的生理過程中, 同時又存在于像腫瘤發(fā)生這樣的病理過程中。很多情況下,細(xì)胞遷移運動并不是隨機(jī)和無目的的, 而是受到趨化因子的觸發(fā)和誘導(dǎo),在趨化因子出現(xiàn)后, 它通過與細(xì)胞表面受體的相互作用,誘導(dǎo)出各種細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)答,如細(xì)胞極化產(chǎn)生、骨架重排、小泡運輸加快等, 這些應(yīng)答反應(yīng)終協(xié)助細(xì)胞完成遷移運動。
細(xì)胞遷移運動過程主要包含以下四個循環(huán)步驟: ①在細(xì)胞遷移的前導(dǎo)端, 局部細(xì)胞膜出現(xiàn)前伸而形成偽足; ②偽足通過黏附結(jié)構(gòu)黏附到基底; ③細(xì)胞骨架收縮, 引起細(xì)胞位置的整體易位; ④尾端脫黏附及回縮。通過以上步驟循環(huán)進(jìn)行, 細(xì)胞將一步步向目的地前行。細(xì)胞黏附、遷移和極化的保持等過程都依賴于整合素的靶向作用及其所包含黏附位點的重組動力, 也即在細(xì)胞前端的胞吐作用能夠為細(xì)胞提供新的黏附受體來輔助細(xì)胞遷移,同時這些運動的受體在細(xì)胞的尾部通過胞吞內(nèi)化, 故由此形成以胞吞和胞吐為調(diào)節(jié)方式的整合素循環(huán)。
腫瘤細(xì)胞骨架發(fā)育缺陷和黏附分子表達(dá)異常必然引起其運動遷移行為發(fā)生改變,其中比較明顯的變化涉及三個方面: ①細(xì)胞連結(jié)普遍削弱, 導(dǎo)致以細(xì)胞間連結(jié)發(fā)達(dá)的上皮類組織細(xì)胞突變轉(zhuǎn)化后出現(xiàn)細(xì)胞隨機(jī)遷徙, 引起組織解體的現(xiàn)象; ②細(xì)胞與基底黏附失調(diào),由于整合素表達(dá)與基質(zhì)金屬蛋白酶分泌異常,導(dǎo)致細(xì)胞黏附不穩(wěn)和脫黏附現(xiàn)象;③腫瘤細(xì)胞普遍軟化(剛度大約比正常細(xì)胞低4倍), 使其黏附的基質(zhì)環(huán)境硬度相對增大, 導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)張力增加, 從而有利其遷移運動。腫瘤細(xì)胞的遷移運動行為并未脫離正常組織細(xì)胞的基本模式,但與正常組織細(xì)胞通過調(diào)動遷移行為參與組織重建相反, 腫瘤細(xì)胞非時、非地及失控的遷移運動將對組織結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性維持產(chǎn)生負(fù)面影響。
細(xì)胞遷移過程中, 諸如遷移速率、遷移效率以及細(xì)胞取向和定位等運動特性均與細(xì)胞的結(jié)構(gòu)功能狀態(tài)密切相關(guān), 腫瘤細(xì)胞因其骨架活動和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常, 雖然遷移速率明顯高于正常細(xì)胞, 但因遷移的方向頻繁發(fā)生改變呈原位“翻滾”, 其遷移路程較長而實際位移很短, 故遷移效率遠(yuǎn)低于正常細(xì)胞。同時, 胞外基質(zhì)的物理特性對細(xì)胞遷移行為也有顯著影響, 正常細(xì)胞能夠感應(yīng)胞外的物理信號, 并相應(yīng)調(diào)整其遷移行為, 如在不同硬度和微觀結(jié)構(gòu)的基底上, 正常細(xì)胞的遷移速率和遷移方向會隨之變化, 細(xì)胞始終如一地向硬度增加的方向遷移。而腫瘤細(xì)胞則顯得比較“遲鈍”, 胞外基質(zhì)的物理特性改變似乎對它們沒有影響或影響很小。正是由于腫瘤細(xì)胞喪失位置信息的識別能力, 相對正常細(xì)胞高效及定位和取向明確等遷移運動特征, 腫瘤細(xì)胞遷移軌跡離散、相鄰細(xì)胞運動協(xié)同性差, 終導(dǎo)致群體細(xì)胞呈無序堆積。
研究腫瘤細(xì)胞遷移常用的是transwell遷移實驗。transwell小室其外形為一個科放置在孔板里的小杯子,底層有一張通透性的膜,這層膜有微孔,孔徑大小有0.1到12μm,根據(jù)不同的需求有不同的材料,常用的是聚碳酸酯膜。在腫瘤細(xì)胞遷移實驗中常用8μm或12μm的膜,上室種腫瘤細(xì)胞,下室加入FBS或其他特定的趨化因子,腫瘤細(xì)胞會向營養(yǎng)成分高的下室遷移,計數(shù)進(jìn)入下室的細(xì)胞可以反映腫瘤細(xì)胞的遷移能力。
Matrigel 是從小鼠EHS肉瘤中提取的基質(zhì)成分,含有LN、IV型膠原、接觸蛋白和肝素硫酸多糖,鋪在無聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯濾膜上,能在DMEM培養(yǎng)基中重建形成膜結(jié)構(gòu),這種膜結(jié)構(gòu)與天然基質(zhì)膜結(jié)構(gòu)極為相似。濾膜孔徑一般為8um,而且膜孔都被Matrigel覆蓋,細(xì)胞不能自由穿過,必須分泌水解酶,并通過變形運動才能穿過這種鋪有Martrigel 的濾膜,這與體內(nèi)情況較為相似。鋪有Martrigel的濾膜放在以Blind Well腔或MICS腔上下室之間,鋪有Martrigel面朝向上室,在下室中加有趨化劑,上室加入重懸的瘤細(xì)胞,具有侵襲能力的細(xì)胞在趨化劑誘導(dǎo)下開始穿膜運動。細(xì)胞穿膜所用的時間與Martrigel的用量有關(guān),選擇 25ugMartrigell鋪膜,16小時后觀察結(jié)果較為合適。穿過濾膜的細(xì)胞多數(shù)粘附在濾膜下表面,可用棉簽將上表面的細(xì)胞拭去,然后用乙醇固定濾膜,PE染色,在光鏡下觀察統(tǒng)計穿過Martrigel的細(xì)胞數(shù)。另外用Transwell小室也可進(jìn)行重建基質(zhì)膜侵襲分析,這一方法是在 Transwell小室吊籃式上腔的濾膜上鋪上30ugMartrigel,加入細(xì)胞72h后觀察結(jié)果。值得注意的是,細(xì)胞在Transwell腔中培養(yǎng) 72小時后,有相當(dāng)數(shù)量穿過濾膜的細(xì)胞不再粘附在濾膜下表面,而是脫落進(jìn)人下腔溶液中.因此統(tǒng)計穿過基質(zhì)膜的細(xì)胞數(shù)目時應(yīng)把這部分細(xì)胞考慮在內(nèi)。腫瘤細(xì)胞穿過重建基質(zhì)膜的能力與它的體內(nèi)侵襲轉(zhuǎn)移能力表現(xiàn)出較好的相關(guān)性,可以用重建基質(zhì)膜模型初篩抗侵襲藥物。
腫瘤細(xì)胞侵襲實驗(Tumour InvasionAssay)可以:(1)研究各種細(xì)胞因子對惡性腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響;(2)一些抑制血管生成的新藥研究;(3)研究腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制。
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