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簡要描述:普通蛋白WB實驗:蛋白質(zhì)印跡法(免疫印跡試驗)即Western Blot。它是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實驗方法。其基本原理是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細胞或生物組織樣品進行著色。通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細胞或組織中表達情況的信息。
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一個基因表達的終結(jié)果是產(chǎn)生相應(yīng)的蛋白質(zhì)(或酶)。因此檢測蛋白質(zhì)是測定基因表達的主要標(biāo)志,檢測蛋白質(zhì)的方法很多,除ELISA法外,也可用與檢測DNA和RNA相類似的吸印方法。前兩法有“南”和“北”之意,故本法遂被延伸稱為Western(西)印跡法,該法能用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨出與專一抗血清結(jié)合的專一性蛋白質(zhì)。將聚丙烯酰胺凝膠上分辨出的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上并與一抗共孵。一抗專一地與待分離蛋自質(zhì)的抗原決定簇結(jié)合,然后用另一種蛋自質(zhì),如135I-蛋白A或辣根過氧化物酶連接的山羊抗IgG檢測已結(jié)合上去的抗體。本法所需時間6小時或過夜。 蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠電泳 幾乎所有蛋白質(zhì)電泳分析都在聚丙烯酰胺凝膠上進行,而所用條件總要確保蛋白質(zhì)解離成單個多肽亞基并盡可能減少其相互間的聚集。常用的方法是將強陰離子去污劑SDS與某一還原劑并用,并通過加熱使蛋白質(zhì)解離后再加樣于電泳凝膠上。變性的多肽與SDS結(jié)合并因此而帶負電荷,由于多肽結(jié)合SDS的量幾乎總是與多肽的分子量成正比而與其序列無關(guān),因此SDS多肽復(fù)合物在聚丙烯酰凝膠電泳中的遷移只與多肽的大小相關(guān)。在達到飽和的狀態(tài)下,每克多肽約可結(jié)合1.4克去污劑,借助已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)參照物,則可測算出多肽鏈的分子量。 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳大多在不連續(xù)緩沖系統(tǒng)中進行,其電泳槽緩沖液的pH值與離子強度不同于配膠緩沖液,當(dāng)兩電極間接通電流后,凝膠中形成移動界面,并帶動加入凝膠的樣品中所含的SDS多肽復(fù)合物向前推進。樣品通過高度多孔性的積層膠后,復(fù)合物在分離膠表面聚集成一條很薄的區(qū)帶(或稱積層)。曲于不連續(xù)緩沖系統(tǒng)具有把樣品中的復(fù)合物全部濃縮于極小體積的能力,故大大提高了SDS聚丙烯酰胺凝膠的分辨率。 廣泛使用的不連續(xù)緩沖系統(tǒng)早是由Ornsstein(1964)和Davis(1964)設(shè)計的,樣品和積層膠中含Tris-Cl(pH6.8),上下槽緩沖液含Tris-甘氨酸(pH8.3),分離膠中含Tris-Cl(pH8.8)的。系統(tǒng)中所有組分都含有0.1%的SDS(Laemmli, 1970),樣品和積層膠中的氯離干形成移動界面的先導(dǎo)邊界而甘氨酸分子則組成尾隨邊界,在移動界面的兩邊界之間是一電導(dǎo)較低而電位滴度較陡的區(qū)域,它推動樣品中的多肽前移并在分離膠前沿積聚,此處pH值較高,有利于甘氨酸的離子化,所形成的甘氨酸離子穿過堆集的多肽并緊隨氯離子之后,沿分離膠泳動。從移動界面中解脫后,SDS多肽復(fù)合物成一電位和pH值均勻的區(qū)帶泳動穿過分離膠,并被篩分而依各自的大小得到分離。
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