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簡要描述:免疫熒光IF實(shí)驗(yàn)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理,先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物,再用這種熒光抗體(或抗原)作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體)。在細(xì)胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有熒光素,利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本,熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光(黃綠色或桔紅色),可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織,從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位,以及利用定量技術(shù)測定含量。
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免疫熒光實(shí)驗(yàn)流程
單標(biāo)記方法
免疫熒光單標(biāo)記是指只標(biāo)記一種蛋白質(zhì)分子,方法比較簡單,只要按照染色步驟去做,通常不存在太多的問題。但要注意固定液的選擇,固定液選擇的合適與否,可能會(huì)直接影響染色結(jié)果。具體染色方法如下。
1、所需材料與試劑
a, 培養(yǎng)在蓋玻片或玻璃培養(yǎng)皿中融合程度達(dá)到60%-70%的細(xì)胞。
b, 一抗、FITC或TRITC標(biāo)記的二抗。
c, 4%多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液 (-20℃預(yù)冷20 min)。
d, 封閉液。
e, 0.01mol/LPBS緩沖液。
2、染色方法
a, 取出培養(yǎng)有細(xì)胞的蓋玻片或glass-bottom培養(yǎng)皿,用0.01MPBS洗2-3遍。
b, 加入0.3%的Tritonx-100, 37℃, 30 rain
c, 加入4%多聚甲醛試問固定30 min或冷丙酮4℃固定10 min。
d,正常阻斷血清1:20封閉試問20-30 min,抑制IgG的非特異性結(jié)合。阻斷血清選擇與二抗同一種屬的正常血清。
e, 去掉正常血清,直接加入一抗,37℃孵育1 h或4℃過夜??贵w以0.01 mo/LPBS稀釋(理想的抗體濃度需經(jīng)試驗(yàn)而定)。
f, 0.3% TritonX-100洗5 min,0.01 mol/IPBS洗5 min,0.3% TritonX 5 min,0.01 M PBS洗5 rain。
g, 加入FITC-二抗或TRITC-二抗,37℃,孵育1h。
h, 0.3%TritonX-100洗5rain,0.01 mol/LPBS洗5min,0.3% Triton X 5min,0.01mol/LPBS洗5 min,用濾紙吸干。
i, 90%甘油(PBS配制)封片。
j, 激光掃描共焦顯微鏡下觀察,或于4℃避光保存。
雙標(biāo)記方法
免疫熒光的雙標(biāo)記是指同時(shí)標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)兩種蛋白質(zhì)分子,當(dāng)懷疑某種配體與已知受體結(jié)合后可用此方法加以證明。此方法稍微復(fù)雜一些,應(yīng)注意所用的一抗是來自不同種屬動(dòng)物的兩種特異性抗體(例如:A抗體為多克隆抗體,來自家兔;B抗體為單克隆抗體,來自小鼠)。其次,兩種二抗所帶熒光素的發(fā)射光不應(yīng)重疊,且盡量遠(yuǎn)離,通常可以選擇FITC和TRITC、Alex488和TRITC、FITC和Cy5,或Cy3和Cy5等來組合。通常情況下,染色時(shí)兩種一抗可以同時(shí)孵育,然后可以同時(shí)孵育兩種二抗。但當(dāng)染色結(jié)果一種顏色非常弱,而另一種顏色比較強(qiáng)時(shí),應(yīng)考慮先孵育顏色較弱的二抗。其他步驟同**熒光單標(biāo)記。
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細(xì)胞株或細(xì)胞爬片。注:細(xì)胞爬片不宜太密;細(xì)胞固定。組織切片,一抗
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