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簡要描述:冰凍切片實驗是一種在低溫條件下使組織快速冷凍到一定硬度,然后進行切片的方法,常用于臨床快速病理診斷。
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冰凍切片步驟
冰凍切片是一種在低溫條件下使組織快速冷凍到一定硬度,然后進行切片的方法,常用于臨床快速病理診斷。以下是基于最新信息的冰凍切片實驗步驟:
1.組織取材:應盡可能快地采取新鮮的材料,以防止組織發(fā)生死后變化。
2.組織速凍:將組織塊平放于軟塑瓶蓋或特制小盒內(nèi),如組織塊小可適量加OCT包埋劑浸沒組織,然后將特制小盒緩緩平放入盛有液氮的小杯內(nèi),使組織迅速冰結(jié)成塊。
3.組織固定:樣品托上涂一層OCT包埋膠,將速凍組織置于其上,4℃冰箱預冷5-10分鐘讓OCT膠浸透組織。
4.切片:將冷凍的樣品置于含OCT復合物的低溫冷箱中,采用標準的冷凍組織切片法。切片時,低溫室內(nèi)溫度以-15℃至-20℃為宜,溫度過低組織易破碎。
5.切片后處理:切好室溫放置30分鐘后,入4℃丙酮固定5-10分鐘,烘箱干燥20分鐘。PBS洗5分鐘×3次。
6.染色:進行抗原熱修復,微波熱修復也可,室溫自然冷卻??捎?%H2O2孵育5-10分鐘,消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。
7.免疫熒光染色:冰凍切片室溫晾干15分鐘,用含10%正常山羊血清的PBS室溫封閉切片1小時,滴加適當比例稀釋的一抗或一抗工作液,室溫孵育2小時或4℃過夜。第二天回收一抗,切片置于染缸內(nèi),PBS洗5分鐘×3次,滴加二抗孵育,回收二抗后進行PBS洗,滴加DAPI工作液染核,室溫10-20分鐘后封片。
8.切片保存:做好的切片放在切片盒內(nèi),置于4℃冰箱,可保存一周左右。
在進行冰凍切片實驗時,應注意組織的溫度平衡、切片機的設置、載玻片的準備以及切片后的固定和染色步驟。這些步驟的優(yōu)化有助于獲得高質(zhì)量的冰凍切片,從而提高診斷的準確性.
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