初代培養(yǎng)或原代培養(yǎng),是從供體獲取組織后的培養(yǎng)。組織和細胞剛剛離體,生物性狀尚未發(fā)生很大的變化,具有二倍體遺傳性狀,在供體來源充分、生物條件穩(wěn)定的情況下(年齡、性別),在一定程度上能 反 映體內(nèi)狀態(tài)。
實驗方法原理
消化培養(yǎng)法
合成培養(yǎng)基胰蛋白酶消化培養(yǎng)法,能把組織塊分散成細胞團或單個細胞,便于細胞從培養(yǎng)液中攝取營養(yǎng)和排出代謝產(chǎn)物,細胞能較快地長成單層。
本法尤適用于培養(yǎng)大量組織,細胞產(chǎn)量高;但用于經(jīng)常性小量培養(yǎng)工作稍顯繁瑣,無菌操作不良時且易污染。
實驗材料
組織
試劑、試劑盒
Hanks 培養(yǎng)液 胰蛋白酶
儀器、耗材
吸管 平皿 培養(yǎng)瓶 燒杯 攪拌器 三角燒杯 眼科剪 眼科鑷 計數(shù)板
實驗步驟
1. 準備
取各種已消毒的培養(yǎng)用品置于凈化臺面,紫外線消毒20 分鐘;
2. 布局
點燃酒精燈(或煤氣燈),安裝吸管帽(應通過火焰);
3. 處理組織
把組織塊置入燒杯中,用Hanks液漂洗2~3 次,去除血污;如懷疑組織可能污染,可先置于含有青鏈霉素的混合液中30~60 分鐘;
4. 剪切
用眼科剪把組織塊切成2~3 毫米大小的塊(用手術刀割亦可),以便于消化;加入比組織塊總量多30~50 倍的胰蛋白酶液,然后一并倒入三角燒瓶中,結扎瓶口或塞以膠塞;
5. 消化
或用恒溫水浴,或置入37 ℃溫箱消化均可,消化中每隔20 分鐘應搖動一次,如用電磁恒溫攪拌器消化更好(消化前瓶中需置一無菌攪棒);消化時間依組織塊的大小和組織的硬度而定;
6. 分離
在消化過程中見消化液發(fā)混濁時,可用吸管吸出少許消化液在鏡下觀察,如組織已分散成細胞團或單個細胞,立即終止消化,隨即通過適宜不銹鋼篩,濾掉尚未充分消化開的組織塊(必要時可繼續(xù)進行消化);低速 (500~1000 轉/分)離心消化液5 分鐘,吸出上清,加入適量含有血清的培養(yǎng)液(如有其它酶或EDTA 等消化,需用Hanks液洗脫一兩次后,再加入培養(yǎng)液);
7. 計數(shù)
用計數(shù)板計數(shù),如細胞懸液細胞密度過大,再補加培養(yǎng)液調(diào)整后,分裝入培養(yǎng)瓶中;對大多數(shù)細胞來說,pH 要求在7.2~7.4范圍,培養(yǎng)液呈微紅色,如顏色偏黃,說膽液體變酸,可用NaHCO3調(diào)整;
8. 培養(yǎng)
置入36.5 ℃溫箱培養(yǎng);如用CO2溫箱培養(yǎng),瓶口需用紗布棉塞或螺旋帽(松口)堵塞,紗布塞易生霉菌,每次換液時需更換新塞。
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