背景:顱腦外傷(TBI)是世界范圍內(nèi)威脅生命的疾病。大多數(shù)中國人由于運動受傷,辦公室或家中意外摔倒以及摩托車受傷而患有TBI。由于社會對疾病的了解不多,因此TBI被稱為“沉默流行病"。 TBI后繼發(fā)性腦損傷引起病理,生理和生物學(xué)反應(yīng),導(dǎo)致腦功能障礙。生物和化學(xué)過程通常觸發(fā)連鎖反應(yīng),可導(dǎo)致炎癥細(xì)胞,能量缺乏,興奮性毒性,細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激在上述過程中起重要作用。氧化會增強炎癥和其他反應(yīng),因此促進(jìn)炎癥和其他反應(yīng)會加劇氧化應(yīng)激并形成惡性循環(huán)。氧化應(yīng)激在TBI后一小時發(fā)生,并立即成為病理反應(yīng)。因此,抗氧化劑策略是治療急性TBI的關(guān)鍵。由于神經(jīng)膜的簡單過氧化作用,大腦容易受到氧化損傷。它們富含脂肪酸,容易被氧化,大腦組織需要大量的氧氣。它占總耗氧量的20%。大腦富含脂質(zhì),使其更容易受到自由基的破壞?;钚匝酰≧OS),例如超氧陰離子,羥基自由基和過氧化氫(H2O2),被認(rèn)為是參與細(xì)胞生長和分化信號傳遞的第二信使。如果ROS的產(chǎn)生和去除不平衡,則會釋放生物系統(tǒng)中的氧化應(yīng)激。過量的ROS產(chǎn)生是在TBI發(fā)展中引起氧化應(yīng)激的重要因素。細(xì)胞在有氧環(huán)境中產(chǎn)生過氧化氫,超氧陰離子,羥基自由基和其他活性氧。這些自由基可以與生物分子相互作用,例如DNA,碳水化合物,蛋白質(zhì),脂質(zhì),并破壞各種細(xì)胞成分。大腦富含抗氧化酶,例如過氧化氫酶(CAT),超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH),可防止氧化損傷。同時,丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSSG)在腦組織中引起氧化應(yīng)激。在氧化條件下,兩個GSH分子提供電子并將其轉(zhuǎn)換為GSSG。 GSH/GSSG摩爾比是很強的氧化應(yīng)激和疾病風(fēng)險指數(shù)。不幸的是,TBI的治療效果遠(yuǎn)不能令人滿意,因為其病因是由高度復(fù)雜和相互作用的機制觸發(fā)的。西藥的抗氧化策略失敗了??茖W(xué)家已經(jīng)開始從中草藥中尋找具有潛在創(chuàng)新性的植物成分,以進(jìn)行抗氧化劑治療。近年來,大黃有效地預(yù)防了由嚴(yán)重腦損傷引起的腦功能障礙。大黃具有抑制大鼠腦組織脂質(zhì)過氧化的作用。大黃可以顯著減少DNA段化,這在乳酸脫氫酶釋放和細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用。近年來,大黃已被用于治療腦部創(chuàng)傷并取得了令人滿意的結(jié)果。大黃作為大黃中重要的活性成分,具有豐富的有效氧化特性。但是,TBI治療的機制仍不清楚。因此,本研究旨在確定大黃酸的抗氧化作用,并進(jìn)一步確定大黃酸是否可以用作大黃的靶向治療材料來治療TBI。
方法:動物和外科手術(shù):在標(biāo)準(zhǔn)溫度22±2℃,12-12明暗循環(huán),相對濕度50±10%的標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)200-300g雄性SD大鼠。試驗前12小時不給大鼠喂食,但給它們充足的水。將108只SD大鼠隨機分為6組,每組分別在3個時間點(8、16和24小時)進(jìn)行功效測試:(1)對照組:TBI后對大鼠進(jìn)行灌胃通過氯化鈉(n = 6)給予等量的生理鹽水(0.9%);(2)假手術(shù)組:大鼠進(jìn)行了相同的手術(shù),只是大腦皮層完整( = 6);(3)12g/kg大黃治療組:同一創(chuàng)傷大鼠口服大黃(n = 6);(4)6g/kg大黃組:同一創(chuàng)傷大鼠后口服大黃。 (N = 6);(5)3g/kg大黃組:在相同的外傷大黃組之后對大鼠口服大黃(n = 6);(6)12mg/kg的雨水組:在對大鼠相同的外傷后口服(n = 6)。皮層電刺激(CCI)用于建立大鼠顱腦損傷模型。用麻醉雄性SD大鼠,并用3D火焰氣錘操作。此后,在顱骨右側(cè)的中央空間側(cè)進(jìn)行手術(shù),用手上的環(huán)戊烷打開前reg和λ之間的中心,僅損傷實驗大鼠的腦表面的一側(cè)。損壞指數(shù)的碰撞深度為5毫米,持續(xù)500毫秒,每秒6米。我們還對對照大鼠進(jìn)行了開顱手術(shù),但并未損害大鼠大腦。然后縫合傷口,將大鼠蘇醒并放置在加熱墊上30-60分鐘以維持正常的體溫。每天觀察受傷的小鼠至少4個小時。
UPLC-MS/MS檢測CCI大鼠腦組織中的大黃酸:向CCI大鼠口服大黃以測量腦組織中吸收的化合物,并通過UPLC-MS/MS測定離子峰和保留時間我測量了將大黃(3 g/kg,6 g/kg,12 g/kg)和大黃酸(12 mg/kg)灌胃給予CCI大鼠。胃內(nèi)給藥后,在第8、16和24小時處死每組大鼠。將大鼠麻醉并以400 mg/kg的劑量腹膜內(nèi)注射10%水合氯醛。 30分鐘后,處死動物,收集腦樣本,用足夠的冰冷的DD水洗滌腦組織樣本,然后加入4 ml冰甲醇進(jìn)行勻漿。在4°C下以3000pm離心勻漿10分鐘。離心后,將混合物蒸發(fā)至干,并在37℃下用氮氣回收上清液。提取液用200μL20%甲醇溶解,溶液在4°C下以15000pm離心15分鐘。離心后,用0.22μm尼龍過濾器過濾上層。將5μL注入UPLC-MS/MS系統(tǒng)并進(jìn)行分析。
估計氧化和抗氧化狀態(tài):用考馬斯亮藍(lán)法測量超氧化物歧化酶活性:使用試劑盒測量總SOD活性。在450nm的波長下測量液體的吸光度?;钚酝ㄟ^蛋白質(zhì)的量校正,并表示為控制時間。讀取450m處的吸光度,并使用以下公式計算SOD活性:[(對照值的空白值)-(樣品的空白值)] /(對照值的空白值)x 2 x(總體積/體積)/蛋白質(zhì)濃度。使用mg/mg蛋白表達(dá)SOD活性。
過氧化氫酶活性的測量:根據(jù)測試試劑盒的說明書測量CAT的活性。在450m波長下測量測試溶液的吸光度。使用摩爾Mmol過氧化氫消耗/分鐘/ mg來表達(dá)酶活性。
MDA含量測定:使用試劑盒測定MDA。要確定MDA含量,請使用(TBA)方法。谷胱甘肽活性和氧化型谷胱甘肽水平的測量:活性谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽均根據(jù)GSH/GSSG檢測試劑盒進(jìn)行操作。 10分鐘后,在分光光度計上記錄405m的吸光度并計算GSH/GSSG比??侴SH含量表示為μmol/ mg蛋白質(zhì)。結(jié)果:抗氧化測試作用Rhubarb和Lein顯著增加了CCI大鼠腦組織中的SOD水平:與假手術(shù)組相比,CCI大鼠的SOD活性明顯降低。與對照組相比,在不同時間點(16小時和24小時),大黃(12 g/kg)和大黃酸(12 mg/kg)顯著增加了SOD水平。與對照組相比,在大黃(6 g/kg)的不同時間點(16 h和24 h),SOD水平顯著增加。與車輛組相比,雨水(12 mg/kg)在8小時內(nèi)增加了SOD含量。大黃(3g/kg和6g/kg)在8小時時與載劑組相比沒有統(tǒng)計學(xué)意義。hubarb和Rein顯著增加CCI大鼠腦組織中的CAT水平:與假手術(shù)組相比,CCI大鼠中CAT活性顯著降低。結(jié)果表明,大劑量大黃(12g/kg)和16h大黃酸(12mg/kg)分別在8h和16h后顯著增加了CAT活性。與媒介物組相比,該線(12 mg/kg)在不同時間點(8小時和24小時)增加了CAT水平。在不同時間點(8、16、24小時),大黃(3 g/kg)與對照組相比沒有統(tǒng)計學(xué)意義。大黃和大黃酸可以顯著降低CCI大鼠腦組織的MDA含量:與假手術(shù)組相比,CCI大鼠的腦MDA含量顯著增加。高劑量大黃(12g/kg)和大黃酸(12mg/kg)16和24小時后,MDA活性顯著降低。與治療組相比,大黃(6g/kg)和大黃酸(12mg/kg)可以在16小時和24小時時顯著降低MDA含量(12mg/kg)。大黃(3g/kg,6g/kg)在8小時內(nèi)與賦形劑組相比沒有統(tǒng)計學(xué)意義。最大的變化發(fā)生在24小時內(nèi)。hubarb和Rein顯著增加CCI大鼠腦組織中的GSH含量和GSH/GSSG比。腦損傷可降低CCI大鼠的GSH含量和GSH/GSSG比,并增加GSSG。結(jié)論:線是大黃灌胃后CCI大鼠大腦中的活性成分。該產(chǎn)品線與大黃在創(chuàng)傷性腦損傷治療中的抗氧化能力相似(通過增加SOD,CAT活性,GSH水平和GSH/GSSG比,以及降低MDA和GSSG)。
結(jié)果表明,大黃和大黃酸可以作為神經(jīng)保護(hù)劑治療TBI。
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