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western blot 之發(fā)光鑒定

更新時(shí)間:2022-04-23      點(diǎn)擊次數(shù):745

一般使用辣根過氧化物酶 HRP-ECL 發(fā)光法或堿性磷酸酶 AP-NBT/BICP 顯色法。


1.HRP-ECL 發(fā)光法:


將 A、B 發(fā)光液按比例稀釋混合。膜用去離子水稍加漂洗,濾紙貼角吸干,反貼法覆于 A、B 混合液滴上,熄燈至可見淡綠色熒光條帶(5 min 左右)后濾紙貼角吸干,置于保鮮膜內(nèi)固定于片盒中,迅速蓋上膠片,關(guān)閉膠盒,根據(jù)所見熒光強(qiáng)度曝光。取出膠片立即*浸入顯影液中 1~2 min,清水漂洗一下后放在定影液中至底片*定影,清水沖凈晾干,標(biāo)定 Marker,進(jìn)行分析與掃描。


2.AP-NBT/BICP 顯色法:


每片 NBT/BICP 可溶解于 30 ml 水中,使用前將一片分裝在 30 個(gè) EP 管中,每張 3×9 cm 的膜取一管配成 1 ml 即可。將 PBST 或 TTBS 洗滌過的膜用去離子水稍加漂洗,濾紙貼角吸干,反貼法覆于 NBT/BICP 溶液液滴上,并用不透明物體(如報(bào)紙)遮擋光線,顯色 20 s 后每 10 s 觀察一次,至條帶明顯或有本底出現(xiàn)時(shí)將膜揭起置去離子水中漂洗后放濾紙上晾干即可觀察與掃描。


注:背景深淺與一抗的質(zhì)量及二抗的量有關(guān),當(dāng)然如果暴光時(shí)間長達(dá)半小時(shí),出現(xiàn)背景是正常的。


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