一. 細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng)
將液氮或- 80℃ 保存的腫瘤細(xì)胞于 37℃ 水浴,快速溶化,用 8.0ml 培養(yǎng)基混勻已融化的腫瘤細(xì)胞懸液,于 1500 轉(zhuǎn)/ 分,離心 3 分鐘。 棄上清,再吸取 8.0ml 培養(yǎng)基質(zhì)混勻細(xì)胞沉淀,再 1500 轉(zhuǎn)/ 分,離心 3 分鐘,棄上清,細(xì)胞沉淀用 1.0ml 培養(yǎng)基混勻,備用。 另取一個 75cm2 方瓶,加入 14.0ml 培養(yǎng)基質(zhì),將上述制備的含 腫瘤細(xì)胞懸液(1.0ml)加入此方瓶中,于 37℃,5%CO2 孵育箱中培養(yǎng)。
若此腫瘤細(xì)胞懸浮生長,大約 3-4 天細(xì)胞基質(zhì)會變黃,5.0ml 細(xì)胞懸液可傳代一個方瓶培養(yǎng),可用 3-4 個方瓶培養(yǎng),一個方瓶中呈對數(shù)生長的腫瘤細(xì)胞可達(dá) 1-1.5×107 個,根據(jù)試驗(yàn)所需,可決定傳代的次數(shù)。 若此腫瘤細(xì)胞呈貼壁生 長,經(jīng)過 3-4 天,腫瘤細(xì)胞生長至 80%-95% 單層時(shí),棄上清,用 0.5mM 的EDTA(難消化的腫瘤細(xì)胞用0.25%胰酶1.0ml),處理腫瘤細(xì)胞大約 3-5 分鐘,用倒置顯微鏡觀察,當(dāng) 90% 的腫瘤細(xì)胞變圓時(shí),即可用彎管吹打并將消化的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到 15ml 離心管中,于 1500 轉(zhuǎn)/ 分下,離心 3 分鐘,棄上清,加少許培養(yǎng)基混勻,可傳代 3 個 75cm2 方瓶擴(kuò)大培養(yǎng)。
二. 細(xì)胞凍存
將對數(shù)生長的腫瘤細(xì)胞用 1 個 75cm2 方瓶按上述方法收集,于 1500 轉(zhuǎn)/分離心 3 分鐘,棄上清,用保種液( 含 10% DMSO 的小牛血清)3.0ml 混勻,分別加入到 2-3 只保種管中,寫上腫瘤細(xì)胞名稱、時(shí)間、保種者姓名,放- 80℃ 保存,次日將它們轉(zhuǎn)移到液氮中保存( 注: -80℃ 下可保存細(xì)胞半年至一年,液氮可保存細(xì) 胞 5-10 年,甚至更長的時(shí)間)。以上所有物品均需經(jīng)過高溫滅菌 ( 121℃,30 分鐘) ,培養(yǎng)基質(zhì)則經(jīng)過過濾(0.22uM)除菌,所有操作均必須遵守?zé)o菌操作技術(shù),避免細(xì)菌、真菌、病原體、衣原體等污染。
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