激光掃描共聚焦顯微鏡可測定的樣品種類很多.包括生物材料、組織(切片)、細(xì)胞(亞細(xì)胞)結(jié)構(gòu)等。樣品中熒光的來源主要有如下幾種:自發(fā)熒光(autofluorescence)、熒光染色、免疫熒光、熒光蛋白、誘發(fā)熒光(induced fluorescence)及酶致熒光(enzymatically produced fluorescence)等等。其中大部分熒光素的激發(fā)和發(fā)射波長均可在儀器自帶軟件的染料信息庫中找到。
1.觀察步驟及儀器操作 根據(jù)實驗要求制備樣品完畢后。即可進行觀察?;静襟E如下:
(1)開啟儀器電源及光源:一般先開啟顯微鏡和激光器,再啟動計算機,然后啟動操作軟件,設(shè)置熒光樣品的激發(fā)光波長,選擇相應(yīng)的濾光鏡組塊。以便光電倍增管(photo multiplier tube,PMT)檢測器能得到足夠的信號結(jié)果。使用汞燈的注意事項同普通熒光顯微鏡。
(2)設(shè)置相應(yīng)的掃描方式:在目視模式下.調(diào)整所用物鏡放大倍數(shù),在熒光顯微鏡下找到需要檢測的細(xì)胞。切換到掃描模式,調(diào)整雙孔針和激光強度參數(shù),即可得到清晰的共聚焦圖像。
(3)獲取圖像:選擇合適的圖像分辨率,將樣品完整掃描后,保存圖像結(jié)果即可。
(4)關(guān)閉儀器:儀器測定樣品結(jié)束后,先關(guān)閉激光器部分,計算機仍可繼續(xù)進行圖像和數(shù)據(jù)處理。若要退出整個激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng).則應(yīng)該在激光器關(guān)閉后,待其冷卻至少10分鐘后再關(guān)閉計算機及總開關(guān)。
2.獲取三維圖像 激光掃描共聚焦顯微鏡具有細(xì)胞“CT"功能,因此,它可以在不損傷細(xì)胞的情況下,獲得一系列光學(xué)切片圖像。選用“Z-Stack"模式,即可實現(xiàn)此項功能。其基本步驟是:
①開啟“Z-Stack"選項;
②確定光學(xué)切片的位置及層數(shù);
③啟動“Start",獲得三維圖像。
3.獲取時間序列圖像 共聚焦顯微鏡的"Time-Series"功能,可以自動在實驗者規(guī)定的時間內(nèi)按照設(shè)定的時間間隔獲取圖像。只需設(shè)定所需的時間間隔以及所需圖像數(shù)量,開啟“Start T"功能鍵,即可進行實驗。“Time-Series"功能大大減輕了實驗者的勞動強度,對于熒光漂白恢復(fù)和鈣離子成像等實驗非常實用。
4.注意事項及維護保養(yǎng)
(1)儀器周圍要遠離電磁輻射源;
(2)環(huán)境無震動,無強烈的空氣擾動;
(3)室內(nèi)具有遮光系統(tǒng),保證熒光樣品不會被外源光漂白;
(4)環(huán)境清潔;
(5)控制工作溫度在5~25℃。
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