人非小細(xì)胞肺癌裸鼠原位種植轉(zhuǎn)移模型的建立:(1)探討肺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和阻斷其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的研究;(2)模擬晚期非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移的自然發(fā)生過程;(3)在活體動物的完整器官內(nèi)評估瘤細(xì)胞播散和腫瘤的生長。
實(shí)驗(yàn)方法原理
將表達(dá)GFP的質(zhì)粒pRNAT-U6/Neo轉(zhuǎn)染人肺腺癌細(xì)胞A549,G418篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)GFP細(xì)胞,對比轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞的生長活性和成瘤性。將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞原位種植裸鼠預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)處死。HE染色和免疫組化檢測轉(zhuǎn)移灶的位置和數(shù)目。利用KODAK IS2000MM系統(tǒng)檢測腫瘤播散情況。
實(shí)驗(yàn)材料
BALB c nu nu裸鼠腺癌細(xì)胞株A549
試劑、試劑盒
小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液pRNAT-U6 Neo磷酸鈣即用型SP超敏 感免疫組化染色試劑盒DAB Kit 顯色試劑盒甲醛EDTA
儀器、耗材
熒光顯微鏡光學(xué)顯微鏡
實(shí)驗(yàn)步驟
一、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備
1. BALB/c nu/nu裸鼠40只,雄性,4-6周齡,體重18-20 g,無特定病原體(SPF)級飼養(yǎng)。
2. 肺腺癌細(xì)胞株A549,用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Gibcobrl公司),5% CO237℃培養(yǎng),常規(guī)傳代。
3. 質(zhì)粒和篩選藥物質(zhì)粒pRNAT-U6/Neo(美國Genscript公司),攜帶Neomycin耐藥基因供篩選,在CMV啟動子控制下編碼cGFP作為轉(zhuǎn)染標(biāo)記物。G418(美國Promega公司)800 μg/ml初篩后200 μg/ml維持篩選。
二、細(xì)胞的轉(zhuǎn)染
1. 哺乳動物磷酸鈣轉(zhuǎn)染系統(tǒng)(美國Promega公司),按照操作指南將質(zhì)粒pRNAT-U6/Neoo轉(zhuǎn)入A549細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后24~48 h熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。
2. 后培養(yǎng)液內(nèi)加G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。
3. 利用平板克隆形成試驗(yàn)測定細(xì)胞克隆形成率>10%后,有限稀釋法獲得表達(dá)GFP陽性細(xì)胞。
4. 1月后收獲轉(zhuǎn)染細(xì)胞,常規(guī)傳代培養(yǎng),培養(yǎng)液中加G418(200 μg/ml)維持篩選。
5. 測定轉(zhuǎn)染后A549細(xì)胞增殖動力學(xué)指標(biāo),對比轉(zhuǎn)染前后A549細(xì)胞生長曲線,檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的生長活性是否受轉(zhuǎn)染的影響。
6. 待細(xì)胞增殖達(dá)一定數(shù)量后,裸鼠皮下注射轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞,記錄成瘤時(shí)間,用公式V=1/2×長×寬 計(jì)算腫瘤體積,對比轉(zhuǎn)染前后兩組裸鼠的瘤體大小以檢測成瘤性是否有差別。
三、人肺腺癌A549裸鼠原位種植模型的建立
1. 取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞,用不含血清的RMPI 1640培養(yǎng)液沖洗2次并調(diào)整細(xì)胞最終濃度為5×106/0.2 ml備用。
2. 用0.5%的麻醉50 mg/kg)(中國醫(yī)藥上?;瘜W(xué)試劑公司)腹腔注射麻醉裸鼠,用26號針頭吸取細(xì)胞懸液0.2 ml注射入裸鼠左側(cè)胸腔,注射過程中注意控制刺入針頭的深度。
3. 整個(gè)操作過程在細(xì)胞收獲后半小時(shí)內(nèi)完成,嚴(yán)格遵循無菌原則。
4. 注射后在KODAK IS2000MM下確認(rèn)原位種植成功,注射部位為胸腔。
5. 注射后繼續(xù)飼養(yǎng),隔天觀察一次并記錄體重。
6. 當(dāng)裸鼠出現(xiàn)精神萎靡、呼吸短促、弓背并明顯消瘦,體重較注射Et減輕20%時(shí),頸椎脫位術(shù)處死裸鼠。
7. 開胸觀察,取出器官,用10%甲醛固定保存。
四、檢查項(xiàng)目
1. 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光顯微鏡成像轉(zhuǎn)染后24~48 h熒光顯微鏡下觀察,確認(rèn)轉(zhuǎn)染成功。單克隆化過程中鏡下觀察細(xì)胞克隆生長情況。
2. 活體GFP標(biāo)記成像檢測應(yīng)用KODAK IS2000MM進(jìn)行活體熒光成像,確認(rèn)注射部位為胸腔,后間斷應(yīng)用以活體確認(rèn)瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。
3. 解剖學(xué)與組織學(xué)檢查處死的裸鼠均經(jīng)
詳細(xì)解剖學(xué)檢查,取出器官、固定包埋后,以4 tun厚度連續(xù)切片,切片嚴(yán)格編號,奇數(shù)號行HE染色,光鏡觀察,以初步確定轉(zhuǎn)移灶。
4. 免疫組織化學(xué)染色
選擇肺臟、肝臟和腦作為主要研究器官,在HE染色確定轉(zhuǎn)移灶位置的基礎(chǔ)上,取相鄰偶數(shù)號碼的切片進(jìn)行免疫組化檢測,CEA鼠抗人單克隆抗體(ZM-0062),LRP鼠抗人單克隆抗體(ZM.0335)工作液,即用型SP超敏感免疫組化染色試劑盒(sP-9000)、抗原修復(fù)液、DAB Kit顯色試劑盒(zU一9032)均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。
五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
細(xì)胞的生長活性和腫瘤體積x±s表示,數(shù)值的比較采用方差分析。HE檢測結(jié)果和活體成像檢測結(jié)果的比較用x2檢驗(yàn)。采用SPSSl3.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
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