1. SD大鼠,250g,通過頸椎脫位處死大鼠,浸入75%乙醇浸泡5分鐘,轉(zhuǎn)移到通風(fēng)柜中的解剖盤中。
2. 打開皮膚,暴露、收集股骨,無菌狀態(tài)下移除附著的肌肉和組織。
3. 并轉(zhuǎn)移股骨至預(yù)冷含雙抗的PBS中,洗滌三次。冰上操作。
4. 切斷股骨骨骺, 使用5mlPBS,1ml注射器針頭沖洗,沖洗液由棕色變成粉紅色即可(股骨變白)。沖洗后,用1ml注射器吹打3-5次。
5. 70um濾網(wǎng)過濾,棄去篩網(wǎng)。使用 15ml 離心管,先加入分離液,然后緩慢加入濾過的懸液。20℃環(huán)境下,600g 離心 25min。
6. 離心后,離心管中液體由上至下分為四層。第一層為稀釋液層。第二層為環(huán)狀乳白色單個核細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。
7. 小心吸取離心管中的,環(huán)狀乳白色單個核細(xì)胞層,轉(zhuǎn)移到新離心管中,加入 5-10ml 洗滌液,混勻細(xì)胞。400g,離心 10min。
8. 棄去上清,用吸管吸取 5ml 清洗液重懸所得細(xì)胞。 250g,離心 10min,棄去上清。 再用M199完丨全培養(yǎng)基(含10 ng/mL VEGF,1 ng/mL b-FGF,1 ng/mL EGF,20%胎牛血清、1%雙抗)清洗一次,棄去上清,M199完丨全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。250g,離心 10min,棄去上清。M199完丨全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,計數(shù)。
9. 按3×106/孔種入纖連蛋白包被過的24孔板,每3天換一次培養(yǎng)基,以去除非貼壁細(xì)胞,持續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)2-3周。
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