免疫熒光實(shí)驗(yàn)是一種基于免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的強(qiáng)大方法,主要原理是利用熒光標(biāo)記的抗體作為探針,定位和定性分析組織或細(xì)胞內(nèi)特定抗原。實(shí)驗(yàn)中,先用已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物,再用這種熒光抗體或抗原作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原或抗體。熒光素受到激光的激發(fā)照射會(huì)發(fā)出明亮的熒光(紅色或綠色),據(jù)此可以觀察到熒光所在的細(xì)胞或組織,從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位,并利用定量技術(shù)測(cè)定其含量。
1、樣品準(zhǔn)備:
對(duì)單層生長(zhǎng)細(xì)胞,在傳代培養(yǎng)時(shí),將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過(guò)的蓋玻片的培養(yǎng)皿中,待細(xì)胞接近長(zhǎng)成單層后取出蓋玻片,PBS洗兩次;對(duì)懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞,用PBS離心洗滌(1000rpm,5min)2次,用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片。
2、固定:
根據(jù)需要選擇適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭?xì)胞。固定完畢后的細(xì)胞可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個(gè)月。PBS洗滌3×5 min。
3、通透:
使用交聯(lián)劑(如多聚甲醛)固定后的細(xì)胞,一般需要在加入抗體孵育前,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行通透處理,以保證抗體能夠到達(dá)抗原部位。選擇通透劑應(yīng)充分考慮抗原蛋白的性質(zhì)。通透的時(shí)間一般在5-15min。通透后用PBS洗滌3×5 min。
4、封閉:
使用封閉液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行封閉,時(shí)間一般為30min。
5、一抗結(jié)合:
室溫孵育1h或者4℃過(guò)夜。PBST漂洗3次,每次沖洗5min。
6、二抗結(jié)合:
間接免疫熒光需要使用二抗。室溫避光孵育1h。PBST漂洗3次,每次沖洗5min后,再用蒸餾水漂洗一次。
7、封片及檢測(cè):
滴加封片劑一滴,封片,熒光顯微鏡檢查。