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簡(jiǎn)要描述:原位雜交實(shí)驗(yàn)(in situ hybridization)將標(biāo)記的核酸探針與細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)行雜交,稱為原位雜交。用原位雜交技術(shù),可在原位研究細(xì)胞合成某種多肽或蛋白質(zhì)的基因表達(dá)。此方法有很高的敏感性和特異性,可進(jìn)一步從分子水平來(lái)探討細(xì)胞的功能表達(dá)及其調(diào)節(jié)機(jī)制。已成為當(dāng)今細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)研究的重要手段。
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原位雜交實(shí)驗(yàn)步驟:前期胚胎的制備。
原位雜交**天進(jìn)行重新水化和固定、預(yù)雜交、雜交。
原位雜交第二天進(jìn)行 1 將探針回收,放于-20C保存(通常探針可重復(fù)使用十次左右)2加入50%甲酰胺/2XSSCT溶液1毫升,60℃,放置30分鐘,重復(fù)一次。3置換2XSSCT1ml,60℃,放置15分鐘。4置換0.2XSSCT1ml,60℃,放置30分鐘,重復(fù)一次。5用MABT洗兩次,每次五分鐘,放在搖床輕輕搖動(dòng)。6室溫下加1ml 1:2:7溶液,時(shí)間為一小時(shí)。 7 按1:3000的比例在1:2:7溶液中加入酶連**抗體,4C 冰箱過(guò)夜。
原位雜交第三天進(jìn)行1) 用1ml含10%熱滅**清的MABT溶液置換抗體溶液,放置搖床上25分鐘,然后用1mlMABT置換,25分鐘,再用1mlMABT溶液置換,一小時(shí)以上,后用1mlMABT溶液置換,25分鐘。2) 用1ml 1mM米睉的Staining buffer洗三次,每次放置五分鐘。3)將胚胎轉(zhuǎn)入十六孔板中,吸去staining buffer,加上300ul BM Purple AP Substrate(底物,用之前加5mM米唑),十六孔板外面包上錫箔紙以避光,避免搖動(dòng),室溫下顯色。4)每隔一小時(shí)觀察胚胎是否開(kāi)始顯色5)將顯色的胚胎中的底物吸出,用PBST洗兩三次后加上4%多聚甲醛固定,拍照。6)4C冰箱保存。
原位雜交實(shí)驗(yàn)服務(wù)內(nèi)容:①細(xì)胞特異性mRNA轉(zhuǎn)錄的定位,可用于基因圖譜,基因表達(dá)和基因組進(jìn)化的研究;
②感染組織中病毒DNA/RNA的檢測(cè)和定位,如EB病毒mRNA、巨細(xì)胞病毒DNA的檢測(cè);
③癌基因、抑癌基因及各種功能基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)及其變化的檢測(cè);
④基因在染色體上的定位;
⑤檢測(cè)染色體的變化,如染色體數(shù)量異常和染色體易位等;
⑥分裂間期細(xì)胞遺傳學(xué)的研究,如遺傳病的產(chǎn)前診斷和某些遺傳病基因攜帶者的確定,某些腫瘤的診斷和生物學(xué)劑量測(cè)定等。
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