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Western Blot實(shí)驗(yàn)

簡要描述:Western Blot實(shí)驗(yàn):Western免疫印跡( Western Blot )是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上,然后利用抗體進(jìn)行檢測(cè)的方法。對(duì)已知表達(dá)蛋白,可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測(cè),對(duì)新基因的表達(dá)產(chǎn)物,可通過融合部分的抗體檢測(cè)。

  • 更新時(shí)間:2022-12-23
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 一個(gè)基因表達(dá)終結(jié)果是產(chǎn)生相應(yīng)的蛋白質(zhì)(或酶)。因此檢測(cè)蛋白質(zhì)是測(cè)定基因表達(dá)的主要標(biāo)志,檢測(cè)蛋白質(zhì)的方法很多,除ELISA法外,也可用與檢測(cè)DNA和RNA相類似的吸印方法。前兩法有“南”和“北”之意,故本法遂被延伸稱為Western(西)印跡法,該法能用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨出與專一抗血清結(jié)合的專一性蛋白質(zhì)。將聚丙烯酰胺凝膠上分辨出的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上并與一抗共孵。一抗專一地與待分離蛋自質(zhì)的抗原決定簇結(jié)合,然后用另一種蛋自質(zhì),如135I-蛋白A或辣根過氧化物酶連接的山羊抗IgG檢測(cè)已結(jié)合上去的抗體。本法所需時(shí)間6小時(shí)或過夜。 蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠電泳 幾乎所有蛋白質(zhì)電泳分析都在聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行,而所用條件總要確保蛋白質(zhì)解離成單個(gè)多肽亞基并盡可能減少其相互間的聚集。常用的方法是將強(qiáng)陰離子去污劑SDS與某一還原劑并用,并通過加熱使蛋白質(zhì)解離后再加樣于電泳凝膠上。變性的多肽與SDS結(jié)合并因此而帶負(fù)電荷,由于多肽結(jié)合SDS的量幾乎總是與多肽的分子量成正比而與其序列無關(guān),因此SDS多肽復(fù)合物在聚丙烯酰凝膠電泳中的遷移只與多肽的大小相關(guān)。在達(dá)到飽和的狀態(tài)下,每克多肽約可結(jié)合1.4克去污劑,借助已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)參照物,則可測(cè)算出多肽鏈的分子量。 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳大多在不連續(xù)緩沖系統(tǒng)中進(jìn)行,其電泳槽緩沖液的pH值與離子強(qiáng)度不同于配膠緩沖液,當(dāng)兩電極間接通電流后,凝膠中形成移動(dòng)界面,并帶動(dòng)加入凝膠的樣品中所含的SDS多肽復(fù)合物向前推進(jìn)。樣品通過高度多孔性的積層膠后,復(fù)合物在分離膠表面聚集成一條很薄的區(qū)帶(或稱積層)。曲于不連續(xù)緩沖系統(tǒng)具有把樣品中的復(fù)合物全部濃縮于極小體積的能力,故大大提高了SDS聚丙烯酰胺凝膠的分辨率。 廣泛使用的不連續(xù)緩沖系統(tǒng)早是由Ornsstein(1964)和Davis(1964)設(shè)計(jì)的,樣品和積層膠中含Tris-Cl(pH6.8),上下槽緩沖液含Tris-甘氨酸(pH8.3),分離膠中含Tris-Cl(pH8.8)的。系統(tǒng)中所有組分都含有0.1%的SDS(Laemmli, 1970),樣品和積層膠中的氯離干形成移動(dòng)界面的先導(dǎo)邊界而甘氨酸分子則組成尾隨邊界,在移動(dòng)界面的兩邊界之間是一電導(dǎo)較低而電位滴度較陡的區(qū)域,它推動(dòng)樣品中的多肽前移并在分離膠前沿積聚,此處pH值較高,有利于甘氨酸的離子化,所形成的甘氨酸離子穿過堆集的多肽并緊隨氯離子之后,沿分離膠泳動(dòng)。從移動(dòng)界面中解脫后,SDS多肽復(fù)合物成一電位和pH值均勻的區(qū)帶泳動(dòng)穿過分離膠,并被篩分而依各自的大小得到分離。

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