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簡要描述:PCR引物設(shè)計實驗:引物設(shè)計是一小段單鏈DNA或RNA,在核酸合成反應(yīng)時,作為每個多核苷酸鏈進行延伸的出發(fā)點而起作用的多核苷酸鏈。
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引物設(shè)計是一小段單鏈DNA或RNA,作為DNA復(fù)制的起始點,在核酸合成反應(yīng)時,作為每個多核苷酸鏈進行延伸的出發(fā)點而起作用的多核苷酸鏈,在引物的3′-OH上,核苷酸以二酯鏈形式進行合成,因此引物的3′-OH,必須是游離的。
1、長度:15—30bp,其有效長度[Ln=2(G十C)十(A十T)]一般不大于38,否則PCR的適延伸溫度會超過Taq酶的作用溫度(74度),從而降低產(chǎn)物的特異性。
2、G十C含量:應(yīng)在40%一60%之間,PCR擴增中的復(fù)性溫度一般較Tm值低等于引物的Tm值減去5—10度。引物長度小于20時,其Tm恒等于4×(G十C)十2×(A十T)。
3、堿基分布的隨機性:應(yīng)避免連續(xù)出現(xiàn)4個以上的單一堿基。尤其是不應(yīng)在其3’端出現(xiàn)超過3個的連續(xù)G或C,否則會使引物在G十C富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。
4、引物自身:不能含有自身互補序列,否則會形成發(fā)夾樣二級結(jié)構(gòu)。
5、引物之間:兩個引物之間不應(yīng)有多于4個的互補或同源堿基,不然會形成引物二聚體,尤應(yīng)避免3’端的互補重疊。
6、上下游引物的互補性:一個引物的3‘末端序列不允許結(jié)合到另一個引物的任何位點上。
7、3’末端:如果可能的話,每個引物的3‘末端堿基應(yīng)為G或C。
8、引物應(yīng)當(dāng)超出限制性內(nèi)切酶識別位點至少3個核苷酸。
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