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免疫熒光染色

簡要描述:免疫熒光染色是一種結(jié)合了免疫學和熒光顯微技術(shù)的方法,用于在細胞或組織中定位和定量特定抗原。該技術(shù)基于抗原-抗體之間的特異性結(jié)合反應(yīng)。

  • 更新時間:2024-09-18
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詳細介紹

免疫熒光染色原理
免疫熒光技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理,先將已知的抗原或抗體標記上熒光素,制成熒光抗體,再用這種熒光抗體(或抗原)作為探針檢測組織或細胞內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體)。在組織或細胞內(nèi)形成的抗原抗體復合物上含有標記的熒光素,利用熒光顯微鏡觀察標本,熒光素受外來激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光(黃綠色或橘紅色),可以看見熒光所在的組織細胞,從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位,以及利用定量技術(shù)測定含量。

免疫熒光染色步驟

細胞準備:對單層生長細胞,在傳代培養(yǎng)時,將細胞接種到預先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中,待細胞接近長成單層后取出蓋玻片,PBS洗兩次;對懸浮生長細胞,取對數(shù)生長細胞,用PBS離心洗滌(1000rpm,5min)2次,用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞涂片。

固定:根據(jù)需要選擇適當?shù)墓潭▌┕潭毎?。固定完畢后的細胞可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個月。PBS洗滌3×5 min.

通透:使用交聯(lián)劑(如多聚jia醛)固定后的細胞,一般需要在加入抗體孵育前,對細胞進行通透處理,以保證抗體能夠到達抗原部位。選擇通透劑應(yīng)充分考慮抗原蛋白的性質(zhì)。通透的時間一般在5-15min.通透后用PBS洗滌3×5 min.

封閉:使用封閉液對細胞進行封閉,時間一般為30min.

一抗結(jié)合:室溫孵育1h或者4℃過夜。PBST漂洗3次,每次沖洗5min.

二抗結(jié)合:間接免疫熒光需要使用二抗。室溫避光孵育1h.PBST漂洗3次,每次沖洗5min后,再用蒸餾水漂洗一次。

封片及檢測:滴加封片劑一滴,封片,熒光顯微鏡檢查。



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