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簡要描述:一類是直接測定進(jìn)行分裂的細(xì)胞數(shù)來評價細(xì)胞增殖能力,如Ki67、BrdU以及EdU細(xì)胞增殖檢測等;一類是通過測定活性細(xì)胞數(shù)目來間接反映細(xì)胞增殖能力,如MTT、CCK-8等。BrdU熒光染色是直接測定DNA合成是細(xì)胞增殖檢測的最準(zhǔn)確方法之一,是測定物質(zhì)毒性、評估藥物安全評價、細(xì)胞健康的基本方法,其中常用的方法有BrdU標(biāo)記法。
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BrdU熒光染色檢測原理
用BrdU預(yù)處理的細(xì)胞中,BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入復(fù)制的DNA雙鏈中,而且這種置換可以穩(wěn)定存在,并帶到子代細(xì)胞中。細(xì)胞經(jīng)過固定和變性處理后,可用免疫學(xué)方法檢測DNA中BrdU的含量(如采用鼠抗BrdU單克隆抗體特異識別BrdU,再采用辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗標(biāo)記,最后用比色法或熒光的方法進(jìn)行定量測定),從而判斷細(xì)胞的增殖能力。
BrdU熒光染色實(shí)驗(yàn)步驟
1.細(xì)胞以1.5×105 /ml細(xì)胞數(shù)接種于直徑35 mm培養(yǎng)皿中(內(nèi)放置一蓋玻片),培養(yǎng)1 d,用含0.4%FBS培養(yǎng)液同步化3 d,使絕大多數(shù)細(xì)胞處于G0期。
2.加入BrdU(儲液:1.0 mg/ml,終濃度為0.03 μg/ml),37℃,孵育40min。
3.棄培養(yǎng)液,玻片用PBS洗滌3次。
4.甲醇/醋酸固定10 min。
5.經(jīng)固定的玻片空氣干燥,0.3%H2O2-甲醇30 min滅活內(nèi)源性氧化酶。
6.5%正常兔血清封閉。
7.甲酰胺100℃,5 min變性核酸。
8.冰浴冷卻后PBS洗滌,加1抗即抗小鼠BrdU單抗(工作濃度1:50),陰性對照加PBS或血清。
9.按ABC法進(jìn)行檢測,蘇木素或伊紅襯染,在顯微鏡下隨機(jī)計數(shù)10個高倍視野中細(xì)胞總數(shù)及BrdU陽性細(xì)胞數(shù),計算標(biāo)記指數(shù)(LI)。
注意事項(xiàng)
1.BrdU配制方法:10 mg溶于10 ml雙蒸水,4℃下避光保存
2.BrdU會肌體造成不可逆損傷,使用時注意安全,避免吸入BrdU粉塵。
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