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簡要描述:單細胞凝膠電泳實驗步驟單細胞凝膠電泳(Single Cell Gel Electrophoresis, SCGE),也稱為彗星試驗(Comet Assay),是一種用于檢測單細胞DNA損傷的實驗方法。
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單細胞凝膠電泳實驗步驟
單細胞凝膠電泳(Single Cell Gel Electrophoresis, SCGE),也稱為彗星試驗(Comet Assay),是一種用于檢測單細胞DNA損傷的實驗方法。
以下是基于最新信息的單細胞凝膠電泳實驗步驟:
1.單細胞懸液的制備:
1.1體外培養(yǎng)的細胞通常使用yi酶消化后,用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)調(diào)整細胞濃度至適宜的密度。
1.2體內(nèi)器官細胞需要從動物體內(nèi)取出后,在適當(dāng)?shù)木彌_液中制備成單細胞懸液。
2.凝膠板的制備:
2.1制備底層膠,通常使用0.5%的正常熔點瓊脂糖(Normal Melt Agarose, NMA)。
2.2在底層膠上加入含有細胞的0.5%低熔點瓊脂糖(Low Melt Agarose, LMA),形成包含細胞的頂層膠。
3.細胞裂解與解旋:
3.1將制備好的凝膠板浸入預(yù)冷的細胞裂解液中,裂解細胞以暴露DNA。
3.2裂解后,將凝膠板在堿性電泳緩沖液中解旋,以便DNA能夠在電場中遷移。
4.電泳:
將凝膠板置于電泳槽中,進行堿性電泳,以分離損傷的DNA片段。
5.中和與染色:
電泳結(jié)束后,使用中和液中和凝膠板,然后用溴化乙錠(Ethidium Bromide, EB)或其他適合的核酸染料染色。
6.顯微觀察:
在熒光顯微鏡下觀察和拍照,分析彗星尾巴的長度和亮度,以定量評估DNA損傷的程度。
注意事項
1.確保使用新鮮的試劑和細胞樣本,以獲得可靠的實驗結(jié)果。
2.電泳過程中應(yīng)保持低溫,以減少DNA降解。
3.裂解液的質(zhì)量對實驗結(jié)果至關(guān)重要,應(yīng)確保裂解液澄清且wanquan溶解。
4.在操作過程中應(yīng)避免DNA損傷,特別是在制備單細胞懸液和凝膠板時。
5.使用適當(dāng)?shù)姆雷o措施處理有害化學(xué)品,如溴化乙錠。
以上步驟綜合了最新的實驗操作指南和技術(shù)建議,確保了實驗的時效性和準(zhǔn)確性.
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