進(jìn)行分子實(shí)驗(yàn)檢測時(shí)需要先準(zhǔn)備PCR反應(yīng)混合物:根據(jù)DNA樣本的數(shù)量來確定除了DNA外其他混合物的體積(額外增加一份來確保有足夠的PCR反應(yīng)混合物),將擴(kuò)增每一個(gè)遺傳標(biāo)記并且在每一個(gè)PCR反應(yīng)管內(nèi)分19.5uL的反應(yīng)混合物。
配制膠溶液:將25g尿素、7.5mL40%丙烯酰胺:PDA(19:1)加入到250mL的錐形瓶中。加蒸餾水至50mL,充分混勻來溶解尿素(見注釋4)。
準(zhǔn)備制膠板:把膠板洗干凈,確保上面沒有灰塵,用硅化玻璃板。根據(jù)各個(gè)廠家的不同把玻璃板夾在一起并且用膠條封住底部(這一過程根據(jù)設(shè)備的不同而有所變化)。
如果不用帶有加熱蓋的PCR儀,那么就需要在每個(gè)管子的頂部加入礦物油來防止液體蒸發(fā)。
進(jìn)行分子實(shí)驗(yàn)檢測時(shí)在每個(gè)管子中加0.5的DNA樣本。
把管子放在PCR儀中,95℃加熱3min變性DNA。
95℃變性40s、55℃引物退火40s、72℃延伸40s,循環(huán)30-35次。
把PCR產(chǎn)物和尿素上樣緩沖液1:1混合.
加入500uL10%的過硫酸銨到膠混合液中并且通過濾紙過濾。
取出10mL膠溶液加入到一個(gè)小燒杯中并且加10~15。馬上將膠倒到板上。幾分鐘之內(nèi)膠將聚合到一起,封玻璃板的底部。
封好膠后,加15ul到剩余的膠溶液中并且馬上把膠倒到兩塊膠板之間。仔細(xì)插入膠梳子,讓膠聚合2h至過夜。
取下膠底部的封條。把膠放在電泳槽中確保電極插入的方向正確。將膠槽中灌滿(大約1.5L,根據(jù)裝置的不同量有所不同)。拔掉膠梳子,沖洗上樣孔。
把膠預(yù)熱60min直到溫度在50℃左右。
在上樣之前再次用加樣器沖洗上樣孔。在每個(gè)孔中加產(chǎn)物和上樣染料(上樣量根據(jù)梳子的大小和PCR產(chǎn)物的濃度而不同)。根據(jù)產(chǎn)物片段大小的不同跑膠時(shí)間可以從30min到3h之間變化。
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