一、原理
培養(yǎng)的細胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長良好,所以要進行細胞計數(shù)。計數(shù)結(jié)果以每毫升細胞數(shù)表示。細胞計數(shù)的原理和方法與血細胞計數(shù)相同。
在細胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細胞,總細胞中活細胞所占的百分比叫做細胞活力,由組織中分離細胞一般也要檢查活力,以了解分離的過程對細胞是否有損傷作用。復蘇后的細胞也要檢查活力,了解凍存和復蘇的效果。
用臺盼蘭染細胞,死細胞著色,活細胞不著色,從而可以區(qū)分死細胞與活細胞。利用細胞內(nèi)某些酶與特定的試劑發(fā)生顯色反應,也可測定細胞相對數(shù)和相對活力。
二、儀器、用品與試劑
1、儀器與用品:普通顯微鏡、血球計數(shù)板、試管、吸管、酶標儀(或分光光度計)
2、試劑:0.4%臺盼蘭,0.5%四甲基偶氮唑鹽(MTT)、酸化異丙醇
3、材料:細胞懸液
三、操作步驟
(一)細胞計數(shù)
1、將血球計數(shù)板及蓋片用擦試干凈,并將蓋片蓋在計數(shù)板上。
2、將細胞懸液吸出少許,滴加在蓋片邊緣,使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間。
3、靜置3分鐘。
4、鏡下觀察,計算計數(shù)板四大格細胞總數(shù),壓線細胞只計左側(cè)和上方的。然后按下式計算:
細胞數(shù)/ml=4大格細胞總數(shù)/ 4×10000
注意:鏡下偶見由兩個以上細胞組成的細胞團,應按單個細胞計算,若細胞團占10%以上,說明分散不好,需重新制備細胞懸液。
(二)細胞活力
1、將細胞懸液以0.5ml加入試管中。
2、加入0.5ml 0.4%臺盼蘭染液,染色2一3分鐘。
3、吸取少許懸液涂于載玻片上,加上蓋片。
4、鏡下取幾個任意視野分別計死細胞和活細胞數(shù),計細胞活力。
死細胞能被臺盼蘭染上色,鏡下可見深蘭色的細胞,活細胞不被染色,鏡下呈無色透明狀。
活力測定可以和細胞計數(shù)合起來進行,但要考慮到染液對原細胞懸液的加倍稀釋作用。
(三)MTT法測細胞相對數(shù)和相對活力
活細胞中的琥珀酸脫氫酶可使MTT分解產(chǎn)生蘭色結(jié)晶狀甲贊顆粒積于細胞內(nèi)和細胞周圍。其量與細胞數(shù)呈正比,也與細胞活力呈正比。
1、細胞懸液以1000rpm離心10分鐘,棄上清液。
2、沉淀加入0.5-1ml MTT,吹打成懸液。
3、37℃下保溫2小時。
4、加入4-5 ml酸化異丙醇(定容)。打勻。
5、1000 rpm離心,取上清液酶標儀或分光光度計570nm比色,酸化異丙醇調(diào)零點。
注意:MTT法只能測定細胞相對數(shù)和相對活力,不能測定細胞絕對數(shù)。
附:1、0.4%臺盼蘭染液配制:
臺盼蘭 0.4克 加雙蒸水至100 ml.
2、MTT配制:
MTT 0.5克,溶于100 ml的磷酸緩沖液或無酚紅的基礎(chǔ)液中。4℃下保存。
3、酸化異丙醇配制:
異丙醇中加入HCl使最終達0.04mol/L。
此文轉(zhuǎn)載來源:丁香通
歡迎您關(guān)注我們的微信公眾號了解更多信息