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克隆形成實驗

簡要描述:克隆形成實驗是測定細胞增殖能力的有效方法之一,貼壁后的細胞不一定每個都能增殖和形成克隆,而形成克隆的細胞必為貼壁和有增殖活力的細胞。細胞克隆形成率表示接種細胞后貼壁的細胞成活并形成克隆的數量,可以反映細胞群體依賴性和增殖能力兩個重要性狀。

  • 更新時間:2022-12-23
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詳細介紹

 
實驗步驟

 

1.取對數生長期的各組細胞,分別用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細胞,并把細胞懸浮在10%胎牛血清的細胞生長培養(yǎng)基中備用。

 

2.將細胞懸液作梯度倍數稀釋,每組細胞每皿分別接種100個細胞于含10ml 37℃預溫培養(yǎng)液的皿中,并輕輕轉動,使細胞分散均勻。

3.置37℃ 5% CO2及飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2~3周。

4.當培養(yǎng)皿中出現肉眼可見的克隆時,終止培養(yǎng)。棄去上清液,用PBS小心浸洗2次。

5.加純甲醇或1:3醋酸/甲醇5ml,固定15分鐘。

6.去固定液,加適量Giemsa應用染色液染10~30分鐘

7.用流水緩慢洗去染色液,空氣干燥。

8.將平皿倒置并疊加一張帶網格的透明膠片,用肉眼直接計數克隆,或在顯微鏡(低倍鏡)計數大于10個細胞的克隆數。后計算克隆形成率。

克隆形成率=(克隆數/接種細胞數)×100%

9.平板克隆形成試驗方法簡單,適用于貼壁生長的細胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。試驗成功的關鍵是細胞懸液的制備和接種密度。細胞一定要分散得好,不能有細胞團,接種密度不能過大。

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