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簡要描述:鬼筆環(huán)肽染色:鬼筆環(huán)肽是一種雙環(huán)七肽,最早發(fā)現(xiàn)的環(huán)狀肽之一,是從鬼筆鵝膏(Amanita phalloides)中分離出來的。通過結(jié)合和穩(wěn)定纖維狀肌動蛋白(F-actin)發(fā)揮功能,并有效防止肌動蛋白纖維解聚。由于其與F-肌動蛋白的緊密和選擇性結(jié)合,從而顯示微絲骨架在細胞中的分布,因此含鬼筆環(huán)肽的熒光標(biāo)記已廣泛用于生物顯微技術(shù)中。
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鬼筆環(huán)肽染色概述
鬼筆環(huán)肽(Phalloidin)是一種從毒蘑菇Amanita phalloides中分離出來的多肽物質(zhì),它能夠與細胞中的肌動蛋白絲(F-actin)結(jié)合,從而用于細胞骨架的染色。
鬼筆環(huán)肽與F-actin的結(jié)合是高度特異性的,不會與肌動蛋白單體(G-actin)結(jié)合,因此它是研究細胞骨架的重要工具。通過使用熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽,可以在熒光
顯微鏡下觀察細胞中微絲的分布和形態(tài)。
步驟
1.配制鬼筆環(huán)肽溶液:通常將0.1mg的鬼筆環(huán)肽溶于1ml無水甲醇中(也可以使用DMSO或無水乙醇),配成貯存液,并在-20°C避光條件下保存。
工作液的濃度通常為5μg/ml,通過將貯存液用PBS稀釋20倍來制備。
2.細胞固定:使用3.7%-4%的甲醛或多聚甲醛固定細胞20分鐘,然后用PBS清洗細胞2次。
3.染色:加入5μg/ml的熒光標(biāo)記鬼筆環(huán)肽,室溫染色30-60分鐘,然后再次用PBS清洗細胞2次。
4.細胞核染色:可以使用DAPI或Hoechst等染料對細胞核進行染色,染色時間通常為10分鐘,之后再次用PBS清洗細胞2次。
5.封片:吸去多余水分后,加入熒光封片液(中性或偏堿性緩沖液加等量甘油),蓋上蓋玻片,準(zhǔn)備在熒光或共聚焦顯微鏡下觀察。
注意事項
1.鬼筆環(huán)肽的分子量小,可以輕易穿透細胞膜,因此通常不需要對細胞進行冷丙酮和Triton X-100處理。
2.鬼筆環(huán)肽具有毒性,操作時應(yīng)戴手套并在通風(fēng)良好的環(huán)境中進行。
3.鬼筆環(huán)肽染色可以與抗體染色結(jié)合使用,以同時觀察細胞骨架和其他細胞結(jié)構(gòu)。
4.避免使用含有甲醇或丙酮的固定劑,因為這些固定劑會破壞肌動蛋白的結(jié)構(gòu),影響染色效果。
應(yīng)用
廣泛應(yīng)用于細胞生物學(xué)研究,包括細胞形態(tài)學(xué)、細胞運動、細胞分裂以及細胞與細胞之間的相互作用等領(lǐng)域。
通過觀察F-actin的分布,研究人員可以更好地理解細胞的功能和病理過程。
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