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簡要描述:動物哮喘模型:是達(dá)為科生物較為成熟的動物模型之一,由動物平臺經(jīng)驗豐富的實驗員操作完成。
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BALB/c小鼠于第0天和第14天分別腹腔注射0.1mL/只OVA液(0.2 mg/mL)和DBP溶液(0.5 mg/kg),第21~23天連續(xù)3天以0.5%的OVA溶液霧化激發(fā),每天于上午下午固定時間霧化2次,每次20min。霧化過程中觀察小鼠一般行為變化,后一次霧化結(jié)束后24小時,小鼠摘眼球取血,取支氣管肺泡灌洗液( Bronchial Alveolar Lavage, BALF )及肺組織。
一般行為學(xué)觀察 觀察小鼠在霧化過程中是否出現(xiàn)撓臉、毛發(fā)豎立、呼吸急促、煩躁不安、大小便失禁等現(xiàn)象。
血中Eos計數(shù) 后一次霧化激發(fā)結(jié)束24h后,小鼠摘眼球取血,獲得血液后立即取出20 μl與380μl 嗜酸性粒細(xì)胞稀釋液混勻,利用細(xì)胞計數(shù)板于光學(xué) 顯微鏡下進(jìn)行Eos計數(shù)。
血清中IgE測定 將獲得的血液靜置2h后,離心,3500 rpm,15min,取血清,按IgE ELISA試劑盒說明書進(jìn)行測定,并通過樣本總蛋白含量進(jìn)行結(jié)果校正。
BALF細(xì)胞分類計數(shù) 將小鼠仰臥位固定,打開胸腔后,結(jié)扎右肺及左側(cè)肺上葉。分離并暴露氣管,用適宜針頭進(jìn)行氣管插管,以預(yù)冷PBS反復(fù)灌洗肺組織(0.5 mL/次,共兩次),收集BALF,低溫離心( 3500 rpm,10min ),取上清,保存于-20℃待測。細(xì)胞沉淀用0.2 mL預(yù)冷PBS重懸,吹打均勻后取10 μl于細(xì)胞計數(shù)板上在光學(xué)顯微鏡下計細(xì)胞總數(shù),剩余細(xì)胞懸液涂片,用快速瑞姬氏染液染色,顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞分類計數(shù)。
BALF中IL-4、IL-5、IL-9、IL-13、IFN-γ的測定 將獲得的BALF上清根據(jù)相關(guān)細(xì)胞因子檢測試劑盒的說明書進(jìn)行各指標(biāo)定量檢測,測定結(jié)果經(jīng)總蛋白含量校正。
肺組織中IL-4和IFN-γ的測定 將右側(cè)肺組織用預(yù)冷的PBS研磨得15 % 組織勻漿,低溫離心,3500 rpm,15min,取上清按照 ELISA 測定試劑盒的操作步驟進(jìn)行IL-4和IFN-γ測定,并通過樣本總蛋白定量來進(jìn)行校正。
肺組織HE及PAS染色 剪取左肺上葉,置10%中性福爾馬林中固定,石蠟包埋,常規(guī)石蠟包埋,切片,HE及PAS染色,鏡下觀察肺組織炎性細(xì)胞浸潤及黏性蛋白增生情況。
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